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Biomedical Engineering - Technology for Regenerative Medicine

Oral questions collection

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Domande teoria medicina rigenerativa 1) Elencare schematicamente le tre principali speci ﬁche di progetto di un sistema per la coltura perfusa (o “dinamica) di un tessuto ingegnerizzato. Per ogni parametro elencato spiegare brevemente come si fa operativamente a garantire che il sistema di coltura soddis ﬁ la speci ﬁca di progetto? Risposta : Nel caso di segnali del sistema di coltura cellulare perfusa o dinamica ci sono tre principali speci ﬁche di progettazione: • Mantenimento della sterilità nella coltura a lungo termine per la sicurezza della coltura stessa. Questa speci ﬁca è garantita da circuiti idraulici chiusi, protocolli per l'assemblaggio sterile e protocolli per la sostituzione del mezzo sterile. • Adeguato trasporto di massa di sostanze nutritive e gas alle cellule e di cataboliti tossici lontano dalle cellule. Questa speci ﬁca è garantita dal calcolo dei pro ﬁli di concentrazione dei soluti e dall'imposizione di condizioni di soglia. •Adeguata stimolazione meccanica delle cellule. La speci ﬁca è garantita dal calcolo del campo di stress meccanico agente sulle cellule e dall'imposizione di condizioni di soglia 2) Elencare quali sono le tre principali modalità di comunicazione cellulare(signaling). Per ogni modalità spiegare brevemente qual’è il meccanismo e dare un ordine di grandezza della velocità di propagazione del segnale? Risposta: Le tre principali modalità di comunicazione cellulare sono: •La segnalazione elettrica è limitata ai soli neuroni e astrociti del sistema nervoso. Questo mezzo di comunicazione ad alta velocità coinvolge il ﬂusso di ioni carichi (Na, K, Ca, Cl) attraverso una membrana: questo processo è noto come propagazione del potenziale d'azione. Le cellule che mediano la segnalazione elettrica sono solitamente intrecciate con pori a bassa resistenza come la gap junction , che consentono il passaggio di ioni e altri soluti di piccole dimensioni tra le cellule •La segnalazione chimica è il metodo di comunicazione più studiato tra le cellule e il loro ambiente. Di solito comporta il legame di un ligando o di una molecola di segnalazione a un recettore situato sulla o vicino alla membrana plasmatica Questo metodo di trasduzione del segnale intracellulare coinvolge molte molecole sia di lipidi che di proteine •La segnalazione meccanica si riferisce a un processo in cui un segnale viene attivato da una forza meccanica come una sollecitazione di taglio o una trazione / spinta applicata alle biomolecole. Di solito, l'applicazione di tale forza indurrebbe un cambiamento conformazionale nella proteina/recettore, esponendo così i domini funzionali all'ambiente Il Mechano-signaling può spesso innescare processi di segnalazione cellulare molto più velocemente di un mezzo di attivazione puramente chimico 3) Spiegare brevemente quali sono le cause di irreversibilità delle ulcere diabetiche, de ﬁnire il principale parametro clinico quantitativo sul quale si misura l’e ﬃcacia di una terapia per il trattamento di ulcere diabetiche. Gra ﬁcare qualitativamente in funzione del parametro de ﬁnito l’e ﬀetto di uno sca ﬀold cellularizzato sulla guarigione di ulcere diabetiche del piede . Risposta: A causa del danno microvascolare causato dal diabete non si attiva il normale processo riparativo che si ha spontaneamente nella Pagina di 120 lesione della cute. Il parametro clinico principale è la percentuale di ulcere che guariscono completamente rispetto al numero totale di ulcere trattate 4) De ﬁnire il concetto di reversibilità di una lesione, per un tessuto a scelta elencare schematicamente a quali componenti della struttura micro anatomica si estende una lesione reversibile e a quali si estende una lesione irreversibile di quel tessuto. Gra ﬁcare l’e ﬀetto di uno sca ﬀold decellularizzato sulla guarigione di una lesione parzialmente reversibile. Risposta: Si de ﬁnisce lesione reversibile una lesione che colpisce solo lo strato del tessuto rigenerativo, guarisce spontaneamente senza contrazione né cicatrice. Si de ﬁnisce invece lesione irreversibile una lesione che si estende allo stroma, oltre lo strato rigenerativo, e guarisce spontaneamente con contrazione e formazione di cicatrice. Per esempio, nei nervi periferici una lesione reversibile sarebbe limitata alla guaina mielinica (continuamente rinnovata dalle cellule di Schwann) che si rigenerano spontaneamente senza contrazione né formazione di cicatrice. Invece una lesione irreversibile si estenderebbe allo stroma dell’endonerium, dove risiedono le cellule chiamate endoneurial ﬁbroblast like cells 5) Quali sono gli indici clinici di perdita progressiva della funzionalità glomerulare? Risposta: Riduzione del ﬁltrato glomerurale o GFR a causa di perdita di funzionalità del capillare glomerurale causa un eccessiva produzione di matrice ecm che porta il capillare a diventare sclerotico. Questo provoca la presenza di proteine plasmatiche nelle urine poiché la membrana del capillare glomerurale non è più in grado di trattenerle (condizione di proteinuria) GFR: glomerular ﬁltration rate, de ﬁnito come il ﬂusso di plasma ﬁltrato attraverso i capillari glomerulari. Il valore ﬁsiologico è circa il 20% del RPF, quindi 0.1 l/min. il 99.4% del GFR è riassorbito da sangue nei capillari peritubulari, il restante 0.6% (1 l/giorno) è espulso sotto forma di urina RPF: ﬂusso renale plasmatico de ﬁnito come la velocità di ﬂusso del plasma processato dai reni. Il valore ﬁsiologico è circa il 10% della velocità di ﬂusso sanguigno (5 l/min), quindi 0.5 l/min. 6) Disegnare un possibile schema del circuito di un fegato bioarti ﬁciale indicandone le componenti e i collegamenti idraulici tra i componenti Pagina di 220 7) Indicare la formula per quanti ﬁcare il tempo di espansione delle cellule in coltura e dare la dimostrazione di come si giunga a tale espressione a partire dai dati:tempo di divisione cellulare td, cellule totali per la terapia Xf e cellule iniziale dal midollo Xi 8) Elencare le principale popolazione cellulare presente nelle ghiandole gastriche della mucosa dello stomaco; e per ciascuna popolazione descrivere la principale funzione Risposta: -Cellule staminali, che si rinnovano e si di ﬀerenziano in tutte le popolazioni presenti nella mucosa; - Cellule neuroendocrine, che secernono 165 tipi di ormoni sistemici; - Cellule principali, che secernono pepsinogeno; - Cellule parietali, che secernono acido cloridrico che attivano il pepsinogeno -Cellule mucose che secernono muco 9) Qual è il parametro adimensionale per stimare la frazione di molecole rimosse o scaricate in un ﬂuido che scorre in un canale (scrivi l'espressione matematica e de ﬁnisci ogni termine)? Come viene de ﬁnito (è il rapporto tra cosa)? Qual è il signi ﬁcato ﬁsico se il parametro è> 1? Quali sono le ipotesi che consentono di applicare questo parametro al dimensionamento di una camera di perfusione planare? Pagina di 320 10) Elencare schematicamente le attuali criticità che devono ancora essere superate, al ﬁne di ingegnerizzare un intero rene fuori dal corpo umano Risposta: Le maggiori criticità sono: •La sorgente cellulare e la relativa tecnica di espansione in grado di fornire un numero su ﬃciente di cellule. • La tecnica per ottenere una ricellularizzazione omogenea. •La necessità dell'endotelizzazione dell'albero vascolare, per evitare la coagulazione del sangue dopo l’impianto. 11) Elencare almeno 4 proprietà dell'idrogel considerate rilevanti per il rilascio di farmaci e cellule al sistema nervoso centrale (SNC) Risposta: -Le proprietà chimiche e meccaniche del materiale, ad esempio, per imitare il microambiente extracellulare in termini di proprietà chimiche, come fattori di crescita e proteine della matrice extracellulare, e proprietà meccaniche in termini di rigidità, porosità e topogra ﬁa. - La capacità di caricare più farmaci / biologici e controllarne il rilascio. - La distribuzione delle cellule all'interno dell'idrogel, che in ﬂuenzerà la loro sopravvivenza e capacità di integrarsi con il tessuto ospite. - La cinetica di rilascio, il cui controllo consente di rilasciare la dose appropriata di fattore di crescita o farmaci in un determinato periodo di tempo, eventualmente con diversi pro ﬁli cinetici contemporaneamente per uno o più agenti. - La capacità di proteggere le proteine dalla degradazione. - La biodegradabilità / bioriassorbibilità del materiale. - L'iniettabilità del sistema di rilascio, che consente un intervento chirurgico minimamente invasivo. - Le interazioni con il sistema immunitario dell'ospite (biocompatibilità). - La non tossicità del sistema di somministrazione e dei suoi prodotti di degradazione. - La stabilità / tempo di geli ﬁcazione, il cui controllo garantisce che l'idrogel biomateriale (e le cellule o le biomolecole incapsulate all'interno) rimangono nel sito di iniezione per ottenere il rilascio locale. Pagina di 420 12) Qual è il parametro adimensionale che fornisce un'indicazione del signi ﬁcato della reazione rispetto alla di ﬀusione in un sistema (scrivi l'espressione matematica e de ﬁnisci ogni termine)? Come viene de ﬁnito (è il rapporto tra cosa)? Qual è il signi ﬁcato ﬁsico se il parametro è> 1? I sistemi biologici generalmente operano a quali valori se questo parametro? 13) Elencare almeno 4 approcci convenzionali per riparare l'osso con una lesione di dimensioni critiche e, per ogni approccio, indicare qual è il limite principale alla sua applicazione Risposta: • Osteogenesi di distrazione, con procedura chirurgica di ﬃcile e molto invasiva • Autograft, altamente demolitivo nel sito di raccolta • Allograft, utilizzando tessuto osseo decellularizzato dalla banca dei tessuti, ad alto rischio di infezione • Sostituti ossei sintetici, caricati anche con fattori osteoinduttivi, che hanno dimostrato di mobilizzare le cellule staminali mesenchimali dal midollo osseo, con limitazioni sulla dimensione del difetto • Autograft di midollo osseo, anche caricato su uno sca ﬀold adatto, con limitazioni sulla dimensione del difetto 14) Qual è il parametro che descrive l'equilibrio tra convezione e di ﬀusione in un tessuto? Fornire un'indicazione del signi ﬁcato della convezione rispetto alla di ﬀusione in un sistema (scrivere l'espressione matematica e de ﬁnire ogni termine). Come viene de ﬁnito (è il rapporto tra cosa)? Qual è il signi ﬁcato ﬁsico se il parametro è> 1? In quali casi la diﬀusione assiale nel tessuto è trascurabile? Pagina di 520 15) Elencare almeno 4 criticità associate al trapianto allogenico di pancreas Risposta: Criticità: •Limitazioni nella disponibilità degli organi •La frazione di pancreas esocrino viene espiantata dal paziente sebbene non malata •Molto invasivo e tecnicamente impegnativo perché il dotto pancreatico deve essere anastomizzato •Necessita di una terapia immunosoppressiva cronica, che causa un aumento del rischio di infezioni, tumori, malattie renali •La funzione dell'isoletta si perde nel 10% dei casi entro 2 anni dal trapianto 16) Spiegare in modo esauriente il modello cinetico che descrive il consumo chimico di un soluto da parte di cellule coltivate. Mostra il gra ﬁco che descrive questa cinetica. De ﬁnire la costante di saturazione e descrivere l'andamento cinetico a valori molto bassi e molto alti di questa costante Pagina di 620 17) Con riferimento a Holoclar, il primo prodotto a base di cellule staminali approvato per la commercializzazione nell'UE, rispondere alle seguenti domande: 1) Qual è l'esatta indicazione clinica per l'uso di questo prodotto a base di cellule staminali, 2) per quale tipo di cellula staminale viene utilizzato la terapia e da quale fonte vengono isolate le cellule, 3) Qual è il biomateriale utilizzato per fornire le cellule al paziente? Risposta: •carenza di cellule staminali limbari della cornea causata da ustione, non estesa allo stroma •cellule staminali limbari della cornea isolate dall'occhio sano controlaterale dello stesso paziente da trattare (fonte autologa) •ﬁbrina 18) Quali sono i principali limiti della ricostruzione mammaria con protesi sintetiche? Risposta: •Indurimento e cambiamento progressivo della forma dell'impianto • Perdita del ﬂuido dell'impianto o altro guasto meccanico Pagina di 720 • Seni disuguali •Necessità di sostituire l’impianto 19) Descrivi l'origine morfogenica delle MSC ed elenca i vantaggi del loro utilizzo nella medicina rigenerativa Le MSC, chiamate anche cellule stromali mesenchimali, sono un sottoinsieme di cellule staminali adulte non ematopoietiche che hanno origine dal mesoderma. • Possiedono capacità di auto-rinnovamento e di ﬀerenziazione multilineare non solo in linee mesodermiche, come condrociti, osteociti e adipociti, ma anche cellule ectodermiche e cellule endodermiche. • Le MSC esistono in quasi tutti i tessuti. Possono essere facilmente isolati dal midollo osseo, dal tessuto adiposo, dal cordone ombelicale, dal fegato fetale, dai muscoli e dai polmoni e possono essere espansi con successo in vitro. • Poiché sono prive di preoccupazioni etiche e hanno numerose fonti, bassa immunogenicità e nessun rischio di teratoma, le MSC sono le cellule staminali più comunemente utilizzate nelle attuali applicazioni cliniche. • Oltre alla loro proprietà di trattare le lesioni dei tessuti, le MSC vengono applicate anche per alleviare i disturbi immunitari perché hanno una potente capacità di regolare le risposte immunitarie. Prochymal, il primo farmaco a base di cellule staminali al mondo approvato in Canada il 12 maggio 2012, ha avuto successo negli studi clinici di fase III nel trattamento della malattia da trapianto contro l'ospite (GvHD) e della malattia di Crohn ed è diventato l'unico farmaco a base di cellule staminali approvato negli Stati Uniti dalla FDA • Si sta cercando di utilizzare prodotti solubili di MSC (cosiddetto "secretoma") invece delle stesse MSC in futuro, il che potrebbe sempli ﬁcare la somministrazione delle cellule e renderla più sicura 20) Elenca i requisiti principali per l’ingegnerizzazione del timo Risposta: • Ambiente cellulare ermeticamente compatto • Ossigenazione strettamente controllata • Due tipi di cellule stromali • Crescita a lungo termine (processo lento) • È necessaria una certa perfusione •Il biomateriale / sca ﬀold è importante (il rene decellularizzato non funziona) 21) Elenca le criticità dell'emodialisi Risposta: •Non elimina le tossine. Pagina di 820 •Non replica l'attività tubulare della produzione di ormoni, con funzione regolatrice, omeostatica, metabolica ed endocrina. •Comporta il rischio di infezione, principalmente nella dialisi peritoneale. •Ha costi elevati e limitazioni in termini di recupero sociale per il paziente. •La dialisi provoca un progressivo deterioramento delle condizioni del paziente. Questa terapia è accettabile per il supporto temporaneo degli organi nell'insu ﬃcienza renale acuta, ma un'alternativa "biologica" è obbligatoria in caso di insu ﬃcienza cronica. 22) Elenca le funzioni renali Risposta: •Depurazione dell'organismo mediante eliminazione di ri ﬁuti (es. Urea) e sostanze tossiche (es. Tossine) attraverso l'urina. •Mantenimento della concentrazione degli elettroliti, cruciali per la funzione cellulare, attraverso la regolazione della loro concentrazione nell'urina eliminata. •Equilibrio dei ﬂuidi corporei, principalmente quelli circolanti, che determinano parametri sistemici come la pressione, attraverso l'eliminazione dell'acqua. •Mantenimento dell'omeostasi del corpo attraverso la secrezione di enzimi (es. Renina) e ormoni (es. Eritropoietina). •Produzione di metaboliti (ad es. Metaboliti della vitamina D) da parte delle cellule tubulari. 23 Elencare tutti i vantaggi e le criticità legate all'uso delle cellule staminali di pluripotenza indotta (iPS) nella medicina rigenerativa Risposta: I vantaggi: Può creare cellule staminali direttamente da un paziente. Può essere mantenuto a tempo indeterminato in laboratorio. Pluripotente con proprietà simili agli ESC. Poiché iPS sono derivati da tessuti adulti, le limitazioni etiche legate all'uso di cellule staminali embrionali verrebbero eliminate e ogni individuo potrebbe essere trattato utilizzando la propria linea di cellule staminali pluripotenti. Si ritiene che le cellule iPS abbiano un potenziale molto elevato di rivoluzionare la medicina. Le criticità che ancora impediscono l'utilizzo di queste cellule nelle terapie sono: La derivazione cellulare iPS è in genere un processo lento e ine ﬃciente, che richiede 1-2 settimane per le cellule di topo e 3-4 settimane per le cellule umane, con e ﬃcienze intorno allo 0,01% -0,1%. Ad oggi, esistono pochissimi protocolli di ri-di ﬀerenziazione di successo verso fenotipi maturi per queste cellule. La neurobiologia è l'unico campo in cui sono presenti protocolli di di ﬀerenziazione stabili. Le cellule iPS formano prontamente un teratoma quando vengono iniettate in topi immunode ﬁcienti. La FDA considera la formazione del teratoma un grosso ostacolo alla medicina rigenerativa basata sulle cellule staminali embrionali. Pagina di 920 24) Elencare le terapie rigenerative convenzionali per il trattamento delle lesioni traumatiche della cartilagine articolare del ginocchio e le relative criticità Risposta: • Stimolazione del midollo osseo (condroabrasione, micro frattura) • Autotrapianto osteocondrale (massiccio o mosaicoplastica) • Autotrapianto periostale (il periostio contiene un'elevata frazione di mesenchimale cellule staminali, ad alto potenziale osteogenico) Criticità: Tutti questi approcci portano alla formazione di un tessuto simile a una cicatrice nel sito della lesione, costituito da cartilagine ﬁbrosa, con proprietà inadeguate a sopportare il carico articolare. Segue una progressiva degenerazione indotta dal carico, che porta all’artroprotesi. 25)Elencare le criticità della tecnica di impianto di condrociti autologhi (ACI) Risposta: Le criticità della tecnica ACI sono: • I condrociti non mantengono il loro fenotipo durante l'espansione monostrato. Si de-diﬀerenziano in un fenotipo simile ai ﬁbroblasti • La tecnica chirurgica richiede due interventi, di cui uno in artroscopia e uno in artrotomia (più invasiva), è molto complessa e lascia il sito di prelievo del lembo periostale irreversibilmente danneggiato • L'indicazione clinica precisa e i metodi di valutazione diagnostica non sono de ﬁniti. •Il rischio / bene ﬁcio e il rapporto costo / bene ﬁcio dell'ACI non hanno ancora dimostrato di essere migliori delle terapie convenzionali. 26)Elenca le cellule del sistema immunitario innato e adattivo Pagina di 1020 27) De ﬁnire la permeabilità e descrivere il coe ﬃciente di permeabilità e le sue unità Risposta: La permeabilità nella meccanica dei ﬂuidi è una misura della capacità di un materiale poroso di consentire ai ﬂuidi di attraversarlo. È tipicamente simboleggiato come Kp, noto come coe ﬃciente di permeabilità. Kp, è de ﬁnito dalla legge di Darcy come Kp = μQh / AΔp dove μ è viscosità del ﬂuido, Q è la portata volumetrica, A la sezione del materiale, Δp è la diﬀerenza di pressione, h lo spessore del materiale. Kp è quindi de ﬁnito come segue: m^2 = [Pa * s] * [m^3 / s] * [m] / [m^2] * [1 / Pa] 28) Elenca gli elementi con cui le cellule staminali mesenchimali (MSC) interagiscono nel loro microambiente nativo Risposta : Le cellule staminali mesenchimali nel loro microambiente nativo interagiscono con: •Varie altre cellule di ﬀerenziate mediante molecole di adesione cellulare •ECM depositato dalle cellule di nicchia, mediato dai recettori dell’integrina •molecole di segnalazione (fattori autocrini, paracrini ed endocrini) •Tensione O2, con ipossia associata a MSC nella nicchia del midollo osseo 29)Elenca i principali organi immunitari primari e secondari e spiega la loro funzione Risposta: Organi primari: Midollo osseo: organo ematopoietico (che forma il sangue) in cui i progenitori delle cellule T cresciuti e le cellule immunitarie e B innate maturano direttamente Timo: crea il repertorio delle cellule T dal midollo osseo Organi immunitari secondari: Linfonodo: innesca i linfociti T e B a diventare cellule attivate / funzionali Milza: serbatoio di cellule immunitarie, centro di reazione immunitaria, puri ﬁcazione del sangue 30)Descrivi il sistema urinario: posta le strutture anatomiche, la loro connessione (disegna uno schema) e la loro funzione. Risposta: Il sistema urinario è composto da reni, ureteri, vescica e uretra. Produce, immagazzina ed elimina l'urina, il liquido di scarto escreto dai reni. I reni producono l'urina ﬁltrando i ri ﬁuti e l'acqua in eccesso dal sangue. Dai reni, l'urina viaggia lungo due tubi sottili, chiamati ureteri, ﬁno alla vescica. I muscoli delle pareti dell'uretere si contraggono e si rilassano continuamente per allontanare l'urina dai reni. La vescica è un organo cavo a forma di palloncino che si trova nel bacino. È tenuto in posizione da legamenti attaccati ad altri organi e alle ossa pelviche. La vescica immagazzina l'urina ﬁno a quando il cervello segnala alla vescica che la persona è pronta a svuotarla. Per evitare perdite, i muscoli circolari chiamati s ﬁnteri si chiudono Pagina di 1120 strettamente attorno all'apertura della vescica nell'uretra, il tubo che consente all'urina di passare all'esterno del corpo. 31)De ﬁnisci una cellula staminale. Risposta Possiamo de ﬁnire "cellula staminale" una cellula che può dividersi in due cellule ﬁglie identiche alla cellula madre, oppure può dividersi in due cellule ﬁglie, di cui una identica alla cellula madre e l'altra impegnata in una speci ﬁca linea di di ﬀerenziazione Pertanto, una cellula staminale è una cellula primitiva in grado di: • auto rinnovo •diﬀerenziazione in diverse linee cellulari 32)Descrivere quale equazione può essere applicata per calcolare la sollecitazione di taglio della parete in sca ﬀold porosi a perfusione interstiziale; indicare chiaramente quali ipotesi devono essere soddisfatte per applicare questa equazione  Risposta: In una coltura di breve durata, le cellule aderiscono alle pareti dell'impalcatura. In questa fase, l'estensione delle cellule nei pori è trascurabile e non in ﬂuisce sul ﬂusso del ﬂuido che la attraversa. In queste condizioni, lo sforzo di taglio generato sulle pareti interne dell'impalcatura è una buona stima dello sforzo di taglio che agisce sulle cellule. Lo sforzo di taglio, τ, generato alla parete interna dal ﬂusso laminare di un ﬂuido attraverso un mezzo poroso può essere calcolato dal modello Wang & Tarbell: dove μ è la viscosità del ﬂuido, Q portata volumetrica, A l'area della sezione trasversale, coe ﬃciente di permeabilità di Kp Darcy. Il modello Wang & Tarbell è valido in caso di ﬂusso laminare, a bassa velocità del ﬂuido, e per coe ﬃcienti di permeabilità Kp≤10-14 m2. Se le suddette condizioni non sono applicabili, il calcolo dello sforzo di taglio idrodinamico agente sulle pareti interne di uno sca ﬀold poroso in perfusione interstiziale può essere e ﬀettuato risolvendo le equazioni di Navier-Stokes applicate alla scala dei pori dello sca ﬀold. 33) Elencare le principali speci ﬁche di progettazione per i sistemi dinamici di coltura cellulare / tissutale; per ogni speci ﬁca, indicare come imporre che la speci ﬁca sia garantita Risposta Le tre principali speci ﬁche di progettazione per i sistemi dinamici di coltura cellulare / tissutale sono: 1) Mantenimento della sterilità nella coltura a lungo termine, ﬁno a diverse settimane di coltura. Questa speci ﬁca è garantita da circuiti idraulici chiusi, protocolli per l'assemblaggio sterile e protocolli per la sostituzione del terreno di coltura sterile. Pagina di 1220 2) Adeguato trasporto di massa di nutrienti e gas alle cellule e di cataboliti tossici lontano dalle cellule. Questa speci ﬁca è garantita dal calcolo dei pro ﬁli di concentrazione dei soluti e dall'imposizione di condizioni di soglia, ad esempio c minimo> c critico. 3) Adeguata stimolazione meccanica delle cellule. Questa speci ﬁca è garantita dal calcolo del campo di stress meccanico agente sulle celle e dall'imposizione di condizioni di soglia, ad esempio, per il livello di sforzo di taglio idrodinamico τ massimo CELLULE E SCAFFOLD: Induzione di pluripotenza (iPS) e cardiomiogenesi su ﬁbroblasti + espansione in vitro di cellule vascolari + production of membrane di materiale polimerico (biocompatibile e biodegradabile) —>COSTRUTTO: Pagina di 1620 Cellularizzazione della membrana—> APPLICAZIONE DI STIMOLI (FISICI E CHIMICI) AL COSTRUTTO: condizionamento atto a replicare i segnali presenti nella nicchia staminale cardiaca—>SOMMINISTRAZIONE: Una volta ottenuto un graft prevascolarizzato, esso viene impiantato nel (suturato al) cuore infartato del paziente B) Risultati pre-clinici di innesti bioingegnerizzati (cardiomiociti embrionali innestati nel cuore di topo) - I cuori che ricevevano il tessuto cardiaco ingegnerizzato avevano una migliore funzione contrattile e le velocità di conduzione attraverso l'infarto erano migliorate, probabilmente perché gli innesti si erano collegati elettricamente al miocardio vitale circostante. Criticità degli innesti bioingegnerizzati • Rischio: potenziale capacità delle cellule staminali pluripotenti di formare un teratoma dopo il trapianto • Integrazione: dopo il trapianto dovrebbe essere una maturazione cellulare. • Numero di cellule: mantenimento della pluripotenza delle ESC / iPS durante l'espansione •Destino cellulare: di ﬀerenziazione delle ESC / iPS ed espressione fenotipica in coltura. I cardiomiociti da ESC / iPS mancano del pro ﬁlo di espressione, della morfologia e della funzione contrattile sincronia dei cardiomiociti ventricolari adulti maturi. 44)Elenca le due principali terapie convenzionali attuali per la malattia renale cronica e descrivi i limiti di entrambe. Risposta: Le principali terapie convenzionali sono: 1) Trapianto ortotopico allogenico per malattia renale allo stadio terminale. Le cui limitazioni sono • numero limitato di donatori • necessità di una immunosoppressione cronica 2) Emodialisi e dialisi peritoneale per la malattia renale cronica. Le limitazioni della dialisi sono: • non elimina le tossine • non replica l'attività tubulare della produzione di ormoni, con funzione regolatrice, omeostatica, metabolica ed endocrina • comporta un rischio di infezione, principalmente nel caso della dialisi peritoneale • ha costi elevati e limitazioni in termini di recupero sociale del paziente. 45)Descrivere le strategie terapeutiche innovative di medicina rigenerativa relative a lesioni del nervo periferico superiori a 30mm. Risposta: Esistono due strategie innovative: • Guide prodotte con matrici orientate e sca ﬀold: le strategie di riparazione includono l'uso di strutture di guida intraluminale con un’architettura micro-scanalate per fornire supporto alla struttura per guidare la rigenerazione degli assoni. Tali strategie prevedono l'utilizzo di condotti ﬁbrosi con i vantaggi di elevata ﬂessibilità e porosità, un elevato volume di area super ﬁciale e ﬁbre che possono essere allineate per la migrazione guidata e la proliferazione cellulare di Schwann e per la crescita assonale. • Guide che agiscono tramite terapia molecolare e cellulare: le guide polimeriche possono essere funzionalizzate / caricate per eseguire terapie molecolari con fattori di crescita, cellule autologhe come le cellule di Schwann, cellule staminali e cellule geneticamente modi ﬁcate. Pagina di 1720 46) Indicare la de ﬁnizione di "medicina basata sull'opinione"e"medicina basata su prove di e ﬃcacia (evidence)". Quale costituisce la base della sperimentazione clinica moderna? Risposta: La medicina sperimentale è passata da una cosiddetta "medicina basata sull'opinione", in cui un medico, de ﬁnito come opinion leader, ha sviluppato e applicato una terapia innovativa (senza la prova scienti ﬁca di un esito più favorevole della nuova terapia rispetto a quelle convenzionali), a una cosiddetta "medicina basata sull'evidenza". Nella medicina basata sull'evidenza, è necessario dimostrare scienti ﬁcamente il risultato di nuove terapie utilizzando studi clinici accuratamente controllati. La prova scienti ﬁca che la terapia innovativa è migliore rispetto alla terapia convenzionale deve quindi provenire dalla signi ﬁcatività statistica. 47)Elencare e descrivere i requisiti minimi per la produzione industriale di PTC secondo gli standard Good Manufacturing Practice Risposta: Secondo gli standard GMP, ci sono cinque requisiti minimi per la produzione di PTC da utilizzare durante i test preclinici, i test clinici e la commercializzazione: • Il nuovo PTC deve includere una strategia per il suo processo di produzione, compresa la scelta del 3. bioreattore più adatto, metodi di monitoraggio, test analitici quantitativi. • Il processo di produzione del nuovo PTC deve essere eseguito con una qualità certi ﬁcata. Ad esempio, secondo la procedura operativa ISO9001, che regola la tracciabilità dei prodotti e dei reagenti e i controlli di qualità. • L'impianto di produzione del nuovo PTC deve soddisfare i requisiti di struttura e ambientali. Ad esempio, la purezza dell'aria deve essere controllata da camere sterili, in cui la pressione dell'aria è maggiore di 4. quella esterna e in cui l'aria viene ﬁltrata e rimessa in circolo con un minimo di 40 rinnovi / ora. Inoltre, la manipolazione del PTC deve essere limitata alle cappe sterili di sicurezza biologica. • La procedura GMP per la realizzazione del nuovo PTC deve essere preventivamente autorizzata dall'autorità sanitaria, che rilascia un'apposita certi ﬁcazione a seguito di un sopralluogo dello stabilimento di produzione. • Periodicamente vengono ripetuti i controlli da parte dell'Autorità sanitaria. Dopo il rilascio del nuovo PTC per la commercializzazione, le procedure GMP vengono aggiornate periodicamente dal produttore, sulla base delle migliori conoscenze scienti ﬁche e tecniche attuali (gli standard GMP sono chiamati "GMP corrente", o cGMP, in questa fase, per sottolineare la loro continua attualizzazione Pagina di 1820 48)Quali sono le fasi di riparazione in una lesione reversibile del nervo periferico (una lesione reversibile è de ﬁnita come una lesione che non si estende allo stroma dell’endonevrio)?Il moncone del nervo prossimale si gon ﬁa, l'assone del nervo distale si rompe e le cellule di Schwann perdono i loro lipidi mielinici  1.l moncone del nervo prossimale si gon ﬁa, l'assone del nervo distale si rompe e le cellule di Schwann perdono i loro lipidi mielinici  2.I macrofagi eliminano la mielina e altri detriti utilizzando la loro attività proteasica (degenerazione walleriana). Questo evento aumenta il potenziale di rigenerazione dei nervi perché le glicoproteine speci ﬁche della mielina inibiscono la rigenerazione dei nervi periferici; in questa fase le cellule di Schwann adottano un fenotipo non mielinizzante.  Le cellule di Schwann nel moncone distale secernono fattori speci ﬁci che stimolano la ricrescita degli assoni. Le strutture costituite da lamina tubolare basale, formate dalla proliferazione di cellule di Schwann dal moncone distale e che guidano il processo di rigenerazione del nervo periferico, sono chiamate “bande di Büngner”. Durante tutta la degenerazione walleriana, questi microtubuli della lamina basale che supportano l'attività delle cellule di Schwann, incanalano gli assoni rigeneranti (prossimali a distali) verso i bersagli muscolari ﬁnali. 3.Dopo l'eliminazione dei detriti, la rigenerazione inizia all'estremità prossimale e continua ﬁno alla riconnessione con il moncone distale. Le bande di Büngner sono il substrato costituito da tratti cellulari, che guidano la rigenerazione nervosa su lunghe distanze. 4.The proximal nerve stump swells, the distal nerve axon breaks down and Schwann cells shed their myelin 49) Si descrivano le componenti principali della comunicazione cellulare. Risposta: - Recettori : sono proteine che interagiscono con ligandi speci ﬁci e trasmettono i segnali risultanti all'interno delle cellule. I recettori sono per lo più proteine transmembrana, con un dominio extracellulare per il legame del ligando e un dominio intracellulare che è spesso legato chimicamente ad una via di signaling a valle. Tre categorie: canali ionici, recettori legati agli enzimi, recettori accoppiati a proteine-G (GPCR). - I messaggeri intracellulari , o messaggeri secondari, sono proteine intermedie o piccole molecole che trasportano un segnale dal recettore ai sensori e agli e ﬀettori intracellulari. Per ogni recettore attivato, vengono attivate più molecole di messaggero intracellulare ed è quindi in questa fase che il segnale viene ampli ﬁcato. - Sensori ed effettori : sono considerati lo stadio ﬁnale del percorso o cascata del segnale, queste proteine sono responsabili della risposta della cellula al segnale. Questi possono promuovere processi come esocitosi, endocitosi, migrazione, rimodellamento dell'actina, espressione genica, ecc. Ne sono esempi i fattori di trascrizione (TF) che inducono l'espressione genica o le proteine che legano l'actina, che inducono il rimodellamento dell'actina, la migrazione cellulare, ecc. 50) Si descrivano le terapie convenzionali per la riparazione del nervo periferico in caso di lesione irreversibile estesa all’endoneurio, e i limiti associati. Risposta: Riparazione chirurgica . Consiste nella sutura microchirurgica delle terminazioni nervose. Può essere applicata per lesioni brevi, quando l'intervento chirurgico non induce tensione nel nervo. L'allineamento chirurgico dei fascicoli originali mediante sutura microchirurgica è fondamentale per contrastare il disallineamento degli assoni (cioè la penetrazione di un assone sensoriale lungo un tubulo precedentemente riempito da un assone originato da un motoneurone e viceversa). Limitazioni : il recupero funzionale è spesso parziale a causa del disallineamento; è un processo lento (la reinnervazione funzionale nell'uomo avviene a una velocità di 2-5 mm / giorno). Innesto di nervo autologo . L'autoinnesto è il gold standard quando i nervi danneggiati non possono essere ricongiunti senza tensione. Le distanze di sezionamento maggiori di 30 mm richiedono un Pagina di 1920 innesto nervoso. La sezione di nervo danneggiata viene tagliata, rimossa e sostituita da un nervo prelevato da un altro sito. Limitazioni : spesso sono necessarie due procedure chirurgiche separate; disponibilità limitata; danno e perdita di funzionalità con neuromi dolorosi nel sito donatore. 51)Disegna uno schema delle prove sperimentali in vitro esistenti, circa l'e ﬀetto dell'anisotropia delle forze intra ed extra cellulari e della tensione di ossigeno sul destino delle cellule staminali embrionali (ESC). Descrivere una possibile con ﬁgurazione di un sistema di coltura in vitro che includa tutti gli stimoli necessari per crescere ed espandere le ESC mantenendo la loro pluripotenza. Dal gra ﬁco è possibile scegliere I seguenti stimuli:  Circa 0.1% di pressione parziale di ossigeno Anisotropia delle forze extracellulari estremamente bassa Anisotropia delle forze intracellulari (tensione sul citoscheletro) estremamente bassa (Queste caratteristiche sono ottenibili, ad esempio, facendo crescere le cellule in un idrogel o nella griglia nichoidale, evitando forze extracellulari e mantenendo la pressione parziale dell'ossigeno allo 0,1% nell'atmosfera dell'incubatore). Pagina di 2020