Biomedical Engineering - Technology for Regenerative Medicine

Parkinson diseases

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Cognome/ Surname _______________ Nome/ Name ______________ Matricola/ R egistration _____________ Prof. Manuela T. Raimondi, Prof, Gianfranco B. Fiore Examination date 04.09.2020 1) Elencare e descrivere i requisiti minimi per la produzione industriale di PTC secondo gli st andard Good Manufacturing Practice (punti 5/33) List and Describe the minimal requirements for the industrial production of PTCs under the Good Manufacturing Practice standards (points 5/33) Secondo gli standard GMP, ci sono cinque requisiti minimi per la produzione di PTC da utilizzare durante i test preclinici, i test clinici e la commercializzazione. 1) Il nuovo PTC deve includere una strategia per il suo processo di produzione, compresa la scelta del bioreattore più adatto, metodi di monitoraggio, test ana litici quantitativi. 2) Il processo di produzione del nuovo PTC deve essere eseguito con una qualità certificata. Ad esempio, secondo la procedura operativa ISO9001, che regola la tracciabilità dei prodotti e dei reagenti e i controlli di qualità. 3) L'impianto di produzione del nuovo PTC deve soddisfare i requisiti di struttura e ambientali. Ad esempio, la purezza dell'aria deve essere controllata da camere sterili, in cui la pressione dell'aria è maggiore di quella esterna e in cui l'aria viene filtrata e rimes sa in circolo con un minimo di 40 rinnovi / ora. Inoltre, la manipolazione del PTC deve essere lim itata alle cappe sterili di sicurezza biologica. 4) La procedura GMP per la realizzazione del nuovo PTC deve essere preventivamente autorizzata dall'autorità san itaria, che rilascia un'apposit a certificazione a seguito di un sopralluogo dello stabilimento di produzione. 5) Periodicamente vengono ripetuti i controlli da parte dell'Autorità sanitaria. Dopo il rilascio del nuovo PTC p er la commercializzazione, le proced ure GMP vengono aggiornate periodicamente dal produttore, sulla base delle migliori conoscenze scientifiche e tecniche attuali (gli standard GMP sono chiamati "GMP corrente", o cGMP, in questa fase, per sottolineare la l oro continua attualizzazione). U nde r GMP standards, there are five minimal requirements for the production of PTCs for use during pre - clinical testing, clinical trials and commercialization. 1) The new PTC must include a strategy for its production process, including the most suitable bior eactor choice, monitoring methods, quantitative analytical tests. 2) The production process for the new PTC must be carried out under a certified quality. For example, under the ISO9001 operative procedure, which rules product and reagents traceability, a nd quality controls. 3) The manufacturing facility for the new PTC must satisfy structural and ambient requirements. For example, air purity must be controlled by sterile rooms, in which the air pressure is greater than outside and in which the air is fil tered and recirculated at minimum 40 renewals/hour. In addition, PTC manipulation must be restricted to sterile biological safety cabinets. 4) The GMP procedure for the manufacturing of the new P TC must be pre - emptively authorized by the health regulator, who releases a specific certification upon an inspection of the manufacturing facility. 5) The inspections by the health regulator are repeated periodically. After release of the new PTC for com mercialization, the GMP procedures are updated periodically by the manufacturer, on the basis of the best current scientific and technical knowledge (the GMP standards are called "current GMP", or cGMP, in this phase, to emphasize their continuous actualiz ation). 2) Quali sono le fasi di riparazione in una lesione reversibile del nervo periferico (una lesione reversibile è definita come una lesione che non si estende allo stro ma dell’endonevrio)? (punti 5/33) What are the repair phases in a reversible lesion of the peripheral nerve ( a reversible lesion is defined a s a lesion not extending to the endonerium stroma)? (points 5/33). 1. Il moncone del nervo prossimale si gonfia, l'assone del nervo distale si rompe e le cellule di Schwann perdono i loro lipidi mielinici 2. I macrofagi eliminano la mielina e altri detriti utili zzando la loro attività proteasica (degenerazione walleriana). Questo evento aumenta il potenziale di rigenerazione dei nervi perché le glicoproteine specific he della mielina inibiscono la rigenerazione dei nervi periferici; in questa fase le cellule di Schwann adottano un fenotipo non mielinizzante. 3. Le cellule di Schwann nel moncone distale se cernono fattori specifici che stimolano la ricrescita degli assoni. Le strutture costituite da lamina tubolare basale, formate dalla proliferazione di cellule di S chwann dal moncone distale e che guidano il processo di rigenerazione del nervo periferico, s ono chiamate “bande di Büngner”. Durante tutta la degenerazione walleriana, questi microtubuli della lamina basale che supportano l'attività delle cellule di Schwa nn, incanalano gli assoni rigeneranti (prossimali a distali) verso i bersagli muscolari final i. 4. Dopo l'eliminazione dei detriti, la rigenerazione inizia all'estremità prossimale e continua fino alla riconnessione con il moncone distale. Le bande di Büngner sono il substrato costitu ito da tratti cellulari, che guidano la rigenerazione nervosa su lunghe distanze. 1. The proximal nerve stump swells, the distal nerve axon breaks down and Schwann cells shed their myelin lipids 2. Macrophages clear myelin and other de bris using their protease activity (Wallerian degeneration). This event increases the potential of nerve regeneration because myelin - specific glycoproteins inhibit peripheral n erve regeneration; in this phase, Schwann cells adopt a non - myelinating phenoty pe. 3. Schwann cells in the distal stump secrete specific factors that stimulate axon regrowth. The structures made of tubular basal lamina, formed by proliferating Schwann cells from the distal stump and guiding the peripheral nerve regeneration process, are called “bands of Büngner”. Throughout the Wallerian degeneration, these microtubules of basal lamina that support the activity of Schwann cells, channel the regenerating axons (proximal to distal) to the final muscular targets 4. After debris clearance, rege neration begins at the proximal end and continues until reconnection with the distal stump. The bands of B ü ngner are the substrate made of cellular tracts, guiding nerve regen eration over long distances 3) Scrivi l'espressione matematica del modello compa rtimentale di trasporto di massa e descrivi il significato fisico di ogni termine dell'equazione (punti 3/33 ) W rite the mathematical expression of the compartmental model of mass transport and describe the physical meaning of each term of the equation (poi nts 2/33) . !" !# ∗ %&' = ) !" " !" − ) #$% " #$% + , − - Dove: &' &% ∗ %&' è il termine di accumulo di massa nel compartimento. ) !" " !" è il termine di trasporto di massa entrante nel compartimento attraverso il suo contorno . ) #$% " #$% è il termine di traspor to di massa uscente dal compartimento attraverso il suo contorno . p è la produzione di massa dovuta a reazioni chimiche all’interno del compartimento. - è il co nsumo di massa dovuto a reazioni chimiche all ’interno del compartimento. Where &' &% ∗ %&' is the term of mass accumulation in the compartment . ) !" " !" is the term of the mass transport into the compartment through its limiting surface . ) #$% " #$% is the term of mass transport out from the compartment through its limitin g surface . p is the mass production from chemical reaction in the compartment . - is the mass consumption from chemical reaction in the compartment . 4) Leggere il testo seguente e rispondere, punto per pu nto, alle relative domande. oggi, i primi dieci pazienti uman i sono stati trattati utilizzando questa strategia terapeutica (punti 3/33) R ead the text below and answer, point by point, to the related questions (points 3/33) . Terapia cellulare per il morbo di Parkinson. Una nuova terapia cellulare per il morbo di Parkinson si basa sull'uso di cellule stro mali mesenchimali (MSC). In questa strategia terapeutica, le cellule vengono espanse in vitro dopo l'isolamento e seminate su uno scaffold polimerico. Il co strutto cellulare viene mantenuto in coltura in un bioreattore che perfonde interstizialmente il cos trutto con plasma ottenuto dal paziente. Ad intervalli regolari, il plasma viene raccolto dopo il suo passaggio nel bioreattore, purificato da metaboliti sp ecifici, e iniettato nella carotide del paziente, in modo che i fattori solubili secreti dalle MSC n el plasma, possano raggiungere i neuroni dopaminergici cerebrali ed esercitare un'azione neuroprotettiva per ritardare il decorso della degenerazione. Ad og gi i primi dieci pazienti sono stati trattati tramite questa strategia terapeutica. Cell therapy for Pa rkinson's disease. A new cell therapy for Parkinson's disease is based on the use of mesenchymal stromal cells (MSC) . In this therapeutic strategy, cell s are expanded in vitro after isolation and seeded on a polymeric scaffold. The cellular construct is maintained in culture in a bioreactor which interstitially perfuses the construct with plasma obtained from the patient. At regular intervals, the plasma is harvested after its passage in the biore actor, purified from specific metabolites, and injected in the carotid of the patient , so that the soluble factors secreted by the MSC in the plasma, can reach the cerebral dopaminergic neurons and exert a neuropr otective action to delay the course of dege neration. To date, the first ten human patients have been treated using this therapeutic strategy. Qual è il prodotto terapeutico? Quali sono gli elementi che identificano il prodotto terapeutico come PTC? Il plasma, caricato con fattori solubili secreti dalle cellule e iniettato nei pazienti. NB: il sangue del paziente non è a diretto contatto con lo scaffold cellularizzato. Il principale agente terapeutico è il plasma arricchito con secretoma ottenuto da cellule ottenute dopo una "manipolazione non minima". In quale fase del processo regolatorio per nuovi PTC si può collocare questo particolare PTC? Quali sono gli standard che si applicano a questa determinata fase del processo di sviluppo del PTC? Clinical trial (fase I). Good Manufacturing Practice (GMP) per la produzione; Good Clinical Practice (GCP) per il clinical trial. Quali sono i rischi associate con questo PTC (immunogenicità, tumorigeninictà, formazione di teratomi, infezione, tossicità)? Rigetto immunologico: SI, perché non conosciamo la fonte cellulare, che potrebbe essere allogenica. Tuttavia, il rischio è moderato perché le cellule non sono impiantate. Formazione di tumori: SI, ma è trascurabile perché il secretoma è sintetizzato da MSC che hanno una tumorigenicità molto bassa Formazione di teratoma: NO, perché IPS \ ESC non vengono né utilizzati né impiantati. Trasmissione di infezioni: SI, da qualsiasi fase di manipolazione e in caso di utilizzo di tessuto donatore. Somministrazione di contaminanti tossici: SI, da qualsiasi fase di manipolazione. What is the therapeutic product? What are the elements that identify the therapeutic product as a PTC? The plasma, loaded with soluble factors secreted by c ells and injected in the patients. NB: the p atient blood is not in direct contact with the cellularized scaffold . The main therapeutic agent is the plasma enriched with secretome obtained from cells that are obtained after a "non - minimal manipulation" . In what phase of the regulatory process for n ew PTCs can this PTC be localized? What are the standards that apply in this stage of the PTC process of development? Clinical trial (phase I) . Good Manufacturing Practice (GMP) for its production; Good Clinical Practice (GCP) for the clinical trial . Wha t are the risks associated with this PTC (immunogenic, tumour, teratoma, infection, toxicity)? Immunological rejection : YES , because we do not know the cell source , which could be heter o lo gous. However, this risk is moderate because the cells are not impla nted . Tumor formation: YE S, but it is negligible because the secretome is synthetized by MSC that have a very low tumorigeni city Teratoma formation: NO , because I PS \ E SC are neither used nor implanted . Transmission of infections YES from any manipulation s tep and in case of use of donor tissue. Administration of toxic contaminants : YES from any manipulation step. 5) Compila la tabella sottostante elencando e discutendo tutti i tipi di cellule che possono essere potenzialmente utilizzati negli esseri umani pe r questa terapia (punti 5/33) . F ill the table below by listing and discussing all the cell types that may be potentially used in humans for this therapy (points 5/33) . Sorgente cellulare (basata su immunogenicità) Tipo cellulare Vantaggi Criticità Autologa MSC isolate dal paziente Compatibilità immunologica Invasività Limitata disponibilità Limitata espandibilità Autologa iPS da cellule somatiche del paziente, ri - differenziate in MSCs Compatibilità immunologica Limitati nei protocolli di ri - differenziamento Si ngenica Cellule staminali embbrionali isolate da clone del paziente e ri - differenziate in MSCs. Compatibilità immunologica a parte il DNA mitocondriale Limiti etici, tecnici e regolatori per cellule derivate da clone Limitati nei protocolli di ri - differenziamento Allogenica MSCs isolate da donatore umano da midollo osseo ed espanse Disponibili da donatori La terapia può essere industrializzata Immunogenicità (basso rischio perché si usa il plasma e non le cellule Rischio di infezione Xenogenica MSCs isolated da donatore non - Disponibil i da allevamenti animali La terapia può essere industrializzata Rigetto immunitario acuto Limitata funzionalità biologica umano da midollo osseo ed espanse Transmissione di xeno - zoonosi Cell source (based on immunogenicity) Cell type/s Advantages Criticalities Autologous MSC isolated from the patient Immunological compatibility. Invasiveness. Limited availability. Limited expandability . Autologous iPS from somatic cells of the patient, differentiated in MSCs . Immunological c ompatibility. Limitations in redifferentiation protocols . Syngeneic Embryonic stem cells isolated from a clone of the patient and re - differentiated in MSC s. Immune - compatible e xcept for the mitochondrial DNA . Ethical, technical and regulatory limitations for cloned cells. Limitations in redifferentiation protocols . Allogeneic MSCs isolated from a human donor of bone marrow and expanded . Available from donors . The therapy can b e industrialized . Immunogenic ity (very low because we are using plasma and not cell s ) Risk of infection Xenogeneic MSCs isolated from a non - human donor of bone marrow and expanded . Largely available from animal stock . Can be industrialized . Acute immun e rejection . Limited biological f unctionality . Transmission of xeno - zoonoses . 6) Durante la coltura nel bioreattore, il mezzo fluido viene ossigenato con un tubo di silicone permeabile all'ossigeno. La portata del fluido è Q = 3.14 ∙ 10 -2 ml/s, il diametro interno del tubo è d = 2 mm e il coefficiente di diffusione dell'ossigeno nel mezzo è D = 2 ∙ 10 -5 cm²/s. Supponiamo che non avvenga alcuna miscelazione (passaggio singolo del fluido nel tubo) e di voler mantener e il numero di Graez sufficientemente piccolo da avere una piena ossigenazione media (Gz = 0.1). Calcolare la lunghezza L necessaria per il tubo ossigenante (sono necessari solo calcoli elementari) (pu nti 3/33) . During culture in the bioreactor, the fluid medium is oxygenated with an oxygen - permeable silicone tube. M edium flow rate is Q = 3 . 14 ∙ /0 ( ) ml/ s, tube inner diameter is d = 2 mm and oxygen diffusion coefficient in the medium is D =2 ∙ /0 ( * cm ²/s. Assume that no mixing occurs (single passage of the fluid in the tube), and you want to keep the Graez number small enough to have full medium oxygenation (Gz=0.1). Calculate the necessary length L for the oxygenating tube (only elementary calculations needed) (points 3/33). d iametro del tubo di silicone d= 2r= 2 mm=0.2 cm à r=0.1 cm portata Q= 3.14 10 -2 ml/ s = 3.14 10 -2 cm 3 /s coefficient e di diffusione dell ’ ossigeno D=2 ∙ 10 ( + cm ²/s sin golo p assaggio per il fluido silicone tube diameter d= 2r= 2 mm=0.2 cm à r=0.1 cm flow rate Q= 3.14 10 -2 ml/ s = 3.14 10 -2 cm 3 /s diffusion oxyge n coefficient D=2 ∙ 10 ( + cm ²/s single pass age of fluid 45 = % ,-.. % /012 = ! " # $ %& = 0 ,1 à 7 = 3 " 4 ∙ 56 7 ,9 - ̅ = : ; = : < ∙ 3 " = ? .9A ∙97 ' " < ∙ 7 .79 'B ( C ∙ 'B " = 1 /D C 7 = 9 E : ∙ - ̅ 0 .1 = 10 ( E 2 ∙ 10 ( + "= E cm E @ ∙ 1 10 ( 9 "= s ∙ = 1 2 ∙ 10 ( A "= = 0 .5 10 A "= = 5000 "= = 50 = O r 45 = % ,-.. % /012 = ! " # $ %& = 0 ,1 à 7 = 3 " 4 ∙ 56 7 ,9 à - ̅ = : ; = : < ∙ 3 " 7 = 9 E : ∙ - ̅ 0 .1 = 9 E : ∙ 1 0 .1 ∙ Q π ∙ 9 E = 10 π ∙ Q D = 10 3 .14 3 .14 10 ( E 2 ∙ 10 ( + "= ? s cm E @ ∙ = 0 .5 10 A "= = 5000 "= = 50 = 7) Le MSC sono seminate su uno scaffold polimerico fatto di microfibre cilindriche solide, impermeabili e tessute di raggio R e mantenute in coltura tridimensionale ad alta densità. All'interno dello scaffold, lo spessore dello strato cellulare c he ricopre la superficie esterna di ciascuna microfibra è di valore costante, s. Il costrutto cellulare viene mantenuto in coltura in un bioreattore che perfonde il costrutto, che garantisce il mantenimento della concentrazione di ossigeno plasmatico, c p . MSC are seeded on a polymeric scaffold made of woven solid , impermeable, cylindrical microfibers of radius R , and maintained in high - density three - dimensional culture. Within the scaffold, the thickness of the cell layer covering the external surface of each micr ofiber is of constant value, s . The cellular construct is maintained in culture in a bioreactor that perfu ses the construct , which guarantees the maintenance of the plasma oxygen concentration, c p . Ricava l'espressione matematica del profilo di concentrazione di ossigeno nello strato cellulare, in stato stazionario e assumendo una simmetria cilindrica. Usa il sistema di coordinate fornito nello schema. Derive the mathematical expression of the oxygen concentration profile in the cell layer, in steady state and assuming a cylindrical symmetry. Use the coordinate sy stem given in the scheme . . 1) Definisci il volume d i controllo in termini matematici. Scrivi l'equazione generale del trasporto di massa nel volume di controllo. Elimina i termini che possono essere considerati nulli o trascurabili all'interno del volume di controllo e giustificane il motivo. Applica le ip otesi pertinenti e giustificale se necessario. Scrivi l'equazione semplificata finale da risolvere (punti 3/33) . Define the control volume in mathematical terms. Write the gen eral equation of mass transport in the control volume. Eliminate the terms that can be considered null or negligible within the control volume and justify why. Appl y the relevant assumptions and justify them if necessary. Write the final simplified equatio n to be solved (p oints 3/33). Il volume di controll o è R < r < R +s The control volume is R < r < R +s ∂ c ∂ t = D ∇ E c + P − % − ( M • ∇ ) c N o n vi è produzione di soluti : P=0, Condizioni stazionarie : F / F G = 0 , Non vi è mo to del fluido all ’ interno del volume di controllo (no conve zione ) ( M • ∇ ) c = 0 V può essere assunto come co stante No solute production: P=0, Steady state: F / F G = 0 , There is no fluid motion in the control volume (no convection) ( M • ∇ ) c = 0 V can be assumed as a constant Simmet ria cilindrica: Cylindrical symmetry: Equazione semplifi cata finale : F inal simplified equatio n : or .2) Scrivi l'espressione matemati ca delle condizioni al contorno e la relativa giustificazione fisica (pu nti 2/33) . Write the mathematical express ion of the boundary conditions and the relevant physical justification (points 2/33). Condizione al contorno Giustificazione fisica b.c.1 9 = O , H' H3 = 0 Flusso nullo all ’ interfaccia tra cellule e fibra dato che la fibbra è solido e d è considerat a impe rmeabile all ’ ossigeno . b.c.2 9 = O + @ , " = " I La con centrazione di ossigeno all ’ int erfac cia tra pla sma e cellule è noto e uguale a c p . úû ù êë é ÷ ø ö ç è æ = Ñ 1 2 r r r r ¶ ¶ ¶ ¶ 0 1 = -úû ù êë é ÷ø ö çè æ V r c r r r D ¶ ¶ ¶ ¶ r D V r c r r =÷ø ö çè æ ¶ ¶ ¶ ¶ Boundary condition Physical justification b.c.1 9 = O , H' H3 = 0 The flux is null at the interface between the cells and the fibre because the fibre is solid and is assumed to be impermeable to oxygen . b.c.2 9 = O + @ , " = " I The oxygen concentration at the interface plasma/cells is known an d it is equal to c p . .3) Ricava l'espress ione matematica del profilo di concentrazione dei nutrienti nel volume di controllo (punti 3/33) . Derive the mathematical expression of the nutrient concentration profile in the c ontrol volume (points 3/33) . à Int egrazione / Integration 1: P" P9 = %9 2 : + Q 9 9 Int egrazione / Integration 2 " ( 9 ) = J A 4 9 E + Q 9 ln ( 9 ) + Q E b.c.1 : r = O , H' H3 = 0 à Q 9 = − J ⋅L " E 4 . b.c.2: r = O + @ , " = " I : à Q E = " I − J E 4 T ( L N O ) " E − O E 'U ( O + @ ) V . Il profil o di concentrazione é: The concentration profile is: " = " I + J A 4 [ 9 E − ( O + @ ) E ] − J E 4 O E 'U 3 ( L N O ) = " I + J A 4 [ 9 E − ( O + @ ) E ] + J E 4 O E 'U L N O ( 3 ) .4) Disegna il grafico del profilo di concentrazione dei nutrienti relativo allo schema del Sistema (punti 2/33) . Draw the plot of the nutrient concentration profile related to the scheme of the system ( points 2/33) . 0 1 = -úû ù êë é ÷ø ö çè æ V r c r r r D ¶ ¶ ¶ ¶ r D V r c r r =÷ø ö çè æ ¶ ¶ ¶ ¶ 1 2 2 k D Vr r c r + = ¶ ¶