Biomedical Engineering - Technology for Regenerative Medicine

Bone

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1 Cognome/ Surname _______________ Nome/ Name _____________ Matricola/ Registration ____________ Prof. Manuela T. Raimondi, Prof, Gianfranco B. Fiore Examination date 0 8 .0 7 .2020 1) Si consideri un monostrato di fibroblasti aderente alla superficie interna di una singola fibra cilindrica (raggio interno R = 100µm) di un bioreattore a fibra cava in cui scorre il mezzo di coltura (viscosità: µ=10 -3 Pa s). Scrivi l'equazione per lo sforzo di taglio, Tau, che agis ce sul monostrato cellulare, in funzione della portata che scorre nella singola fibra, Q . Calcola la portata massima della fibra, Q max , che garantisce l'adesione cellulare, sapendo che lo sforzo di taglio massimo sostenuto dalle cell ule è pari a 4 Pa. I calcoli richiedono solo passaggi elementari. (punti 5/33) C onsider a fibroblast monola yer adhering to the internal surface of a n individual cylindrical fiber ( inner radius R= 100µm ) of a hollow - fiber bioreactor in which culture medium ( viscosity: µ= 10 -3 Pa s ) flows . Write th e equation for the shear stress , Tau , acting on the cell monolayer , as a function of the flow rate flowing in the single fiber, Q . C alculate the maximum fiber flow rate , Q max , that guarantee s cell adhesion , knowing that the maximum shear stress supported by the cells is equal to 4 Pa . Calculations require only elementary passages. (points 5/33) Sforzo di taglio in un a fibra cava ( condotto ) circ olare : S hear stress i n a hollow cylindric al fi b er: ! !" = 4 %& ' ( # M assima p ortata che garantisce l ’ adesione (N.B.: 1ml =1 0 -6 m 3 ) : Maximum flow rate that guarantees adhesion (N.B.: 1ml =1 0 -6 m 3 ) : % $%& = ' !"# ( ) $ * + = # .-* ∙* ∙0 - ∙-1 % & 2 $ * ∙-1 % $ ) 3 % ∙$ $ 3% ∙4 * = # .-* ∙-1 % '( -1 % $ [ , # - ⁄ ] = 3 .14 ∙ 10 5 6 [ , # - ⁄ ] = 3 .14 ∙ 10 5 # [ ,5 - ⁄ ] 2 ) Disegna uno schema delle prove sperimentali in vitro esistenti , circa l'effetto dell'anisotropia delle forze intra ed extra cellulari e della tensione d i ossigeno sul destino delle cellule staminali embrionali (ESC). Descrivere una possibile configurazione di un sistema di coltura in vi tro che includa tutti gli stimoli necessari per crescere ed espandere le ESC mantenendo la loro pluripotenza. (punti 3/33) Draw a scheme of the existing in vitro experimental evidence of the effect of anisotropy of intra - and extra - cellular forces and oxyg en tension on the fate of embryonic stem c ell s (ESC) . Describe a possible configuration of an in vitro culture system that includes all the stimuli necessary to grow and expand ESC while maintaining their pluripotency . (points 3/33) 2 Dal grafico è possib i le scegliere I seguenti stimuli : Circa 0.1% di pressione parziale di ossigeno Anisotropia delle forze extracellulari estremamente bassa Anisotropia delle forze intracellulari (t ensione sul citoscheletro) estremamente bassa (Queste caratteristiche sono ottenibili, ad esempio, facendo crescere le cellule in un idrogel o nella griglia nichoidale, evitando forze extracellulari e mantenendo la pressione parziale dell'ossigeno allo 0,1% nell'atmosfera dell'incubatore). From the graph is possible to choose the followin g stimuli Around 0.1% pressure of oxygen Extremely low anisotropy of extracellular forces Extremely low anisotropy of cytoskeletal tension (These features are obtainable, for example, by growing cells in a hydrogel or in the nichoid g rid, avoiding extra - cellular forces and maintaining the oxygen partial pressure at 0.1% in the atmosphere of the incubator ) . 3 ) Elencare gli approcci clinici convenzionali utilizzati per riparare il tessuto osseo colpito da una lesione di dimensioni critiche e, per ciascun approccio, indicare quali sono i limiti all'applicazione di tale approccio. (punti 5/33) List the conventional clinical approaches used to repair bone tissue affected by a critical size lesion and, for each approach, indicate what are the limitations to the application of such approach . (points 5/33) • D istrazione osteogenetica , procedura chirurgica difficile e molto invasiva • Autograft , altamente demolitivo nel sito di raccolta • Allograft , utilizzando tessuto osseo decellularizzato da banca di tessuti, ad alto rischio di infezione • Sostituti ossei sintetici , caricati anche con fattori osteoinduttivi, ch e hanno dimostrato di mobilizzare le cellule staminali mesenchimali dal midollo osseo, con limitazioni sulla dimensione del difetto • Autotrapianto di midollo osseo , anche caricato su uno scaffold adatto, con limitazioni sulla dimensione del difetto • Distraction osteogenesis , with a difficult and very invasive surgical procedure • Autograft , highly demolitive at the harvest site • Allograft , using de - cellularised bone tissue from tissue bank , highly risky for infection • Synthetic bone substitutes , also loaded with osteoinductive factors, which are proven to mobilize mesenchymal stem cells from bone marrow, with limitations on defect size • Bone marrow autograft , also loaded into a suitable scaffold, with limitations on defect size 4 ) Leggi il testo sottostante e rispondi punto per punto alle relative domande. (punti 3/33) Una terapia cellulare per rigenerare il tessuto in un difetto osseo di dimensioni critiche si basa sull'uso di cellule stromali mesenchimali (MSC). In questa strategia terapeutica, le cellule vengono isolate dal paziente, espanse in vitro e seminate in un idrogel sintetico biodegradabile. Il costrutto cellularizzato viene quindi iniettato in un difetto osseo di forma sferica del paziente per stimolare la rigenerazione del tessuto osseo. Ad oggi, questo PTC è stato commercializzato da una società farmaceutic a. 3 Read the text below and answer, poin t by point, to the related questions. (points 3/33) A cell therapy to regenerate tissue in a bone defect of critical size is based on the use of mesenchymal stromal cells (MSC) . In this therapeutic strategy, cells are isolated fr o m the patient , expanded in vitro and seeded into a biodegradable synthetic hydrogel . The cellularised construct is then injected in a bone spherical defe c t of the patient to stimulate bone tissue regeneration. To date , t his PTC has been commercialized by one pharmaceutical company . Qual è il prodotto terapeutico? Quali sono gli elementi che identificano il prodotto terapeutico come PTC? L'idrogel caricato con MSC Il principale agente terapeutico sono le cellule, ottenute dopo "manipolazione non minima" consistente nell'isolamento cellulare e nell'espansione cellulare In quale fase del processo regolatorio per nuovi PTC si può collocare questo particolare PTC? Quali s ono gli standard che si applicano a questa determinata fase del processo di sviluppo del PTC? Commercializzazione ( F ase IV ). Good Manufacturing Practice (cGMP) Quali sono i rischi associate con questo PTC (immunogenicità, tumorigeninictà, formazione di teratomi, infezione, tossicità)? Rigetto immunologico : NO perché le cellule sono autologhe Formazione di tumori : SI, a causa dell'idrogel e potenzialmente di MSC, ma la probabilità di formazione di tumori associata a MSC è molto bassa Formazione di teratoma : NO perché non vengono utilizzate cellule pluripotenti Trasmissione di infezioni : SI da qualsiasi procedura di manipolazione. Somministrazione di contam inanti tossici : SI da qualsiasi procedura di manipolazione. What is the therapeutic product ? What are the elements that identify the therapeutic product as a PTC The hydrogel loaded with the MSC The main therapeutic agent are the cells, obtained after "non - minimal manipulation" consisting in cell isolation and cell expansion In what phase of the regulatory process for new PTC s can this PTC be localized ? What are the standards that apply in this stage of the PTC process of development ? C ommercialization (phase I V ) Current Good Manufacturing Practice ( c GMP) What are the risks associated with this PTC (immunogenic, tumour, teratoma, infection, toxicity)? Immunological rejection : NO because the cells are autologous Tumor formation : YES , due to the hydrogel and possibly to MSC s , but t he probability of tumor formation associated to MSC is very low Teratoma formation : NO because pluripotent cells are not used Transmission of infections : YES from any manipulation procedure. Administration of toxic contaminants : YES from any manipulation procedure . 4 5 ) Compila la tabella sottostante elencando e discutendo tutti i tipi di cellule che possono essere potenzialmente utilizzati negli esseri umani per questa terapia (punti 5/33). Fill the table below by listing and discussing all the cell types that may be potentially used in humans for this therapy (points 5/33). Sorgente cellulare (basata su immunogenicità) Tipo cellulare Vantaggi Criticità Autologa MSC isolate dal midollo osseo del paziente Compatibilità immunologica Disponibilità limitata. Espandibilità limitata. Invasività della raccolta cellulare. Rischio di tumore (molto basso). Autologa iPS da cellule somatiche del paziente, ri - differenziate in MSCs Compatibilità immunologica Limitati nei protocolli di ri - differenziamento Rischio di teratoma Singenica Cellule staminali embbrionali isolate da clone del paziente e ri - differenziate in MSCs. Compatibilità immunologica a parte il DNA mitocondriale Limiti etici, tecnici e regolatori per cellule derivate da clone Limitati nei protocolli di ri - differenziamento Rischio di teratoma Allogenica MSCs isolate da donatore umano da midollo osseo ed espanse Disponibili da donatori La terapia può essere industrializzata Immunogenicità (basso rischio per via dell’uso di MSC) Rischio di infezione Rischio di tumore (molto basso per MSC ). Xenogenica MSCs isolated da donatore non - umano da midollo osseo ed espanse Disponibili da allevamenti animali La terapia può essere industrializzata Rigetto immunitario acuto Limitata funzionalità biologica Transmissione di xeno - zoonosi Rischio di tumore (molto basso per MSC ). Cell source (based on immunogenicit y) Cell type/s Advantages Criticalities Autologous MSC isolated from the bone marrow of the patient and expanded . Immunological compatibility. Limited availability. Limited expandability. Invasiv eness of cell harvest . Risk of tumor (very low) . Autologous iPS obtained from somatic cells of the patient and differentiated in MSC . I mmunological Compatibility. Limitations in R edifferentiation protocols . Risk of teratoma . Syngeneic Embryonic stem cells isolated from a clone of the patient and differentiated in MSC . Immunological compatibility with the exception of the mitochondrial DNA. Ethical, technical and regulatory limitations for cloned cells. Limitations in redifferentiation protocols. Risk of teratoma. 5 Allogeneic MSC isolated F rom a human bone marrow donor and expanded . Available from bone marrow banks . Can be Industrialized. Immunogenicity (very limited for MSC) . Risk of infection . Risk of tumor ( very limited for MSC) . Xenogeneic MSC isolated from a non - human donor and expanded . Largely available from animal livestock. Can be industrialized. Risk of acute immune rejection. Risk of xeno - zoonoses. Limited biological f unctionality. Risk of tumor (very limited for MSC). 6) Terapia cellulare per difetti ossei con di mensione Cell therapy for critical size bone defects In questa strategia terapeutica, un idrogel sintetico biodegradabile caricato con MSC autolog he viene iniettato in un difetto osseo di forma sferica del paziente per stimolare la rigenerazione del tessuto osseo. Nell'idrogel, la densità cellulare è di 1 milione di cellule/ml, il difetto ha raggio R e la conce ntrazione di nutrienti all'interfaccia tra l'osso e il costrutto cellularizzato è c in . La concentrazione minima per garantire una quantità sufficiente di nutrienti è c min = c in /10. Le cellule nel costrutto cellularizzato consumano il nutriente a un tasso di consumo volumetrico costante, V . Deriva re l'espressione matematica del profilo di concentrazione dei nutrienti nell'idrogel caricato con le cellule MSC, in condizioni stazionari e e assumendo una simmetria sferica. Usa il sistema di coordinate fornito n ello schema. 6.1) Defini sci il volume di controllo in termini matematici. Scriv i l'equazione generale del trasporto di massa nel volume di controllo. Eliminare i termini che possono essere considerati nulli o trascurabili all'interno del volume di controllo e giustificarne il motivo. Applicare le ipotesi pertinenti e giustificarle se necessario. Scrivi l'equazione semplificata finale da risolvere (punti 3/33). In this therapeutic strategy, a biodegradable synthetic hydrogel loaded with autologous MSC is injected in a bone spherical defect of the patient to stimulate bone tissu e regeneration. In the hydrogel, cell density is 1 million cells/ml, t he defect has radius R , and the nutrient concentration at the interface between bone and the cellularised construct is c in . The minimum concentration to guarantee sufficient nutrient is c min = c in /10. Cell s in the cellularised construct consume the nutrient at a constant volumetric consumption rate , V . Derive the mathematical expression of the nutrient concentration profile in the hydrogel loaded with the MSC cells , in steady state and assuming a spherical symmetry. Use the coordinate system given in the scheme . 6 .1 ) Define the control volume in mathematical terms. Write the general equation of mass transport in the control volume. Eliminate the terms that can be considered null or negligible within the control volume and justify why. Apply the relevant assumptions and justify them if necessary. W rite the final simplified equation to be solved (p oints 3/33). Cin 6 Il volume di controllo è 0 = D ∇ 7 c = D 1 r 7 ∂ ∂ r E r 7 F ∂ c ∂ r G H Control volume is 0 = D ∇ 7 c = D 1 r 7 ∂ ∂ r E r 7 F ∂ c ∂ r G H 6.2) Scriv i l'espressione matematica delle condizioni al contorno e la relativa motivazione fisica (punti 2/33). Write the mathematical expression of the boundary conditions and the relevant physical justification (points 2/33). Condizione al contor no Motivazione fisica r=0 à 8 9 8 ; = 0 Il flusso di nutrient i è nullo nei luoghi di simmetria . r = R à c = c