Biomedical Engineering - Technology for Regenerative Medicine

Exam resolution in class 15/06/2020

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1 Cognome Nome Codice persona Surname Name Person code Tecnologie per la medicina rigenerativa Prof. Manuela T. Raimondi, Prof. Gianfranco B. Fiore Appello 15.06.2020 Call 1) Si consideri un fibroblasto, aderente alla superficie inferiore di un micro-bioreattore, soggetto a un moto planare di Couette del mezzo di coltura (µ=1cP), generato dallo scorrimento della parete superiore, distante h=100µm dalle cellule, come mostrato in figura. La parete superiore ha velocità U M=400mm/s. Scrivere l’equazione dello sforzo di taglio agente sulla cellula. Sotto l’ipotesi che la cellula aderente possa essere descritta come un rettangolo piano (50x100 µm), calcolare il numero minimo di adesioni focali che la cellula necessita per contrastare la forza generata dal moto del fluido. La forza generata da una singola adesione focale è f = 5nN. (punti 5/33) Consider a fibroblast on the bottom surface of a microbioreactor in culture medium (µ=1cP), experiencing a Couette planar flow generated by the upper wall, which is distant h=100µm from the cell, and moves with a velocity U M=400mm/s, as shown in figure. Write the equation for the shear stress acting on the cell. Under the hypothesis that the cell in adhesion can be represented as a flat rectangle (50x100 µm), estimate the minimum number of focal adhesion points that the cell needs to withstand the force generated by the flow. The force generated by a single focal adhesion is f = 5nN. (points 5/33) L’equazione generale per lo sforzo di taglio alla parete è: τ = µ dv x/dy Per questo caso particolare, il gradiente di velocità può essere identificato con la pendenza del profilo di velocità lineare, quindi lo sforzo di taglio può essere calcolato come: τ = µ U M /h La forza tangenziale agente sulla cellula è data dallo sforzo di taglio moltiplicato per l’area che la cellula espone al flusso: F shear = µ U M A/h, dove A viene stimata come l’area del rettangolo piano: A = 5×10 −9 ������������2. Questa forza viene contrastata dalle adesioni focali con cui la cellula aderisce alla superficie. Quindi il numero minimo di adesioni focali è dato da: N foc = F shear / f , ovvero: ������������������������������������������������ =������������ ������������ ������������������������ ℎ������������ =10 − 3 ������������������������ ������������2 ∙4 ×10 −1 ������������ ������������ ∙5×10 −9 ������������2 10 −4 ������������∙5×10 −9 ������������ =4 The general equation for the wall shear stress is: τ = µ dv x/dy For this particular case, the velocity gradient can be simplified to the slope of the linear velocity profile, hence the shear stress may be calculated as: τ = µ U M /h 2 The shear force acting on the cell is given by the shear stress times the area that the cell exposes to the flow: F shear = µ U M A/h, where A is estimated as the area of the flat rectangle: A = 5×10 −9 ������������2. This force is withstood by the focal adhesion points that the cell adheres to the surface with. Hence the minimum number of focal adhesion points necessary is given by: N foc = F shear / f , or: ������������ ������������������������������������ =������������ ������������ ������������������������ ℎ������������ =10 − 3 ������������������������ ������������2 ∙4 ×10 −1 ������������ ������������ ∙5×10 −9 ������������2 10 −4 ������������∙5×10 −9 ������������ =4 2) Si descrivano le componenti principali della comunicazione cellulare. (punti 5/33). 2) Describe the key components of cell signalling. (points 5/33). - Recettori: sono proteine che interagiscono con ligandi specifici e trasmettono i segnali risultanti all'interno delle cellule. I recettori sono per lo più proteine transmembrana, con un dominio extracellulare per il legame del ligando e un dominio intracellulare che è spesso legato chimicamente ad una via di signaling a valle. Tre categorie: canali ionici, recettori legati agli enzimi, recettori accoppiati a proteine-G (GPCR). - I messaggeri intracellulari, o messaggeri secondari, sono proteine intermedie o piccole molecole che trasportano un segnale dal recettore ai sensori e agli effettori intracellulari. Per ogni recettore attivato, vengono attivate più molecole di messaggero intracellulare ed è quindi in questa fase che il segnale viene amplificato. - Sensori ed effettori: sono considerati lo stadio finale del percorso o cascata del segnale, queste proteine sono responsabili della risposta della cellula al segnale. Questi possono promuovere processi come esocitosi, endocitosi, migrazione, rimodellamento dell'actina, espressione genica, ecc. Ne sono esempi i fattori di trascrizione (TF) che inducono l'espressione genica o le proteine che legano l'actina, che inducono il rimodellamento dell'actina, la migrazione cellulare, ecc. - Receptors: proteins that interact with specific ligands and transmit the resulting signals to the cell interior. Receptors are most often transmembrane proteins, with an extracellular domain for ligand binding and an intracellular domain that is often chemically linked to a downstream signalling pathway. Three categories: Ion channels, Enzyme-linked receptors, G-protein coupled receptor (GPCRs). - Intracellular messengers, or secondary messengers, are the intermediate proteins or small molecules that carry a signal from the receptor to intracellular sensors and effectors. For every receptor that is activated, multiple intracellular messenger molecules are activated and therefore it is at this stage that the signal is said to be amplified. - Sensors and effectors: considered the final stage in the signalling pathway or cascade, these proteins are responsible for the cell’s response to the signal. These may promote processes such as exocytosis, endocytosis, migration, actin remodelling, gene expression, etc. Examples include transcription factors (TF) which induce gene expression or actin binding proteins, which induce actin remodelling, cell migration, etc. 3) Si descrivano le terapie convenzionali per la riparazione del nervo periferico in caso di lesione irreversibile estesa all’endoneurio, e i limiti associati. (punti 3/33). 3) Describe the conventional therapies for peripheral nerve repair in case of irreversible lesions, extending to the endonerium, as well as their limitations. (points 3/33). 3 Riparazione chirurgica. Consiste nella sutura microchirurgica delle terminazioni nervose. Può essere applicata per lesioni brevi, quando l'intervento chirurgico non induce tensione nel nervo. L'allineamento chirurgico dei fascicoli originali mediante sutura microchirurgica è fondamentale per contrastare il disallineamento degli assoni (cioè la penetrazione di un assone sensoriale lungo un tubulo precedentemente riempito da un assone originato da un motoneurone e viceversa). Limitazioni: il recupero funzionale è spesso parziale a causa del disallineamento; è un processo lento (la reinnervazione funzionale nell'uomo avviene a una velocità di 2-5 mm / giorno). Innesto di nervo autologo. L'autoinnesto è il gold standard quando i nervi danneggiati non possono essere ricongiunti senza tensione. Le distanze di sezionamento maggiori di 30 mm richiedono un innesto nervoso. La sezione di nervo danneggiata viene tagliata, rimossa e sostituita da un nervo prelevato da un altro sito. Limitazioni: spesso sono necessarie due procedure chirurgiche separate; disponibilità limitata; danno e perdita di funzionalità con neuromi dolorosi nel sito donatore. Surgical repair. It consists in microsurgical suturing of the nerve endings. It can be applied for short lesions, when the surgery does not induce tension in the nerve. Surgical alignment of the original fascicles by microsurgical suturing is critical to counteract axon misalignment (i.e. the penetration of a sensory axon down a tubule previously filled with an axon originating from a motor neuron, and vice versa). Limitations: functional recovery is often partial due to misalignment; it is a slow process (functional reinnervation in humans occurs at a rate of 2-5 mm/day). Autologous nerve graft. The autograft is the gold standard when damaged nerves cannot be rejoined without tension. Transected distances larger than 30 mm require a nerve graft. The crushed section of nerve is cut, removed, and replaced by a nerve taken from another site. Limitations: two separate surgical procedures are often needed; limited availability; damage and loss of function with painful neuromas at the donor site. 4) Si consideri la terapia descritta di seguito e si risponda brevemente alle domande in tabella. (punti 3/33). Al fine di creare un organo bioingegnerizzato, un rene di ratto viene decellularizzato mediante perfusione di un detergente, producendo uno scaffold privo di cellule con architettura vascolare, corticale e midollare, un sistema di raccolta e l'uretere. Per rigenerare un intero organo funzionale, vengono seminate MSC autologhe su questo scaffold, e fatte differenziare in cellule renali. Il costrutto ricellularizzato viene perfuso con terreno di coltura completo in un bioreattore per organi interi. L'organo bioingegnerizzato risultante produce pseudo-urina in vitro quando perfuso attraverso il suo letto vascolare intrinseco. Dopo la coltura nel bioreattore, il rene ricellularizzato viene trapiantato in posizione ortotopica in ratti, usati come modello di nefropatia cronica, una condizione per la quale la terapia convenzionale è l'emodialisi. L'organo impiantato in vivo risulta perfuso con successo dalla circolazione del ricevente e produce urina attraverso il condotto ureterale. 4) Consider the therapy described below and answer briefly to the questions in the table (points 3/33). To create a bioengineered organ, a rat kidney is decellularised by detergent perfusion, yielding an acellular scaffold with vascular, cortical and medullary architecture, a collecting system and the ureter. To regenerate a whole functional organ, autologous MSCs are seeded and differentiated on this scaffold into renal cells. The recellularised construct is perfused with complete culture medium in a whole-organ bioreactor. The resulting bioengineered organ produces pseudo-urine in vitro when perfused through its intrinsic vascular bed. After culture in the bioreactor, the recellularised kidney is transplanted in an orthotopic position in a rat model of chronic nephropathy, a condition for which the conventional therapy is hemodialysis. The implanted organ was successfully perfused in vivo by the recipient's circulation and produced urine through the ureteral conduit. 4 Qual è il prodotto terapeu tico ? Quali sono gli elementi che identificano il prodotto terapeutico come PTC? Il costrutto ricellularizzato (rene decellularizzato, ricellularizzato con MSC). Il principale agente terapeutico sono le MSC, ottenute dopo "manipolazione non minima" consistente nella decellularizzazione del rene di ratto, ricellularizzazione con MSC e loro differenziazione. In quale fase del processo regolatorio si localizza questo PTC? Quali sono gli standards da applicare in questo stadio del processo di sviluppo del PTC? Sperimentazione preclinica (animale). Good Manufacturing Practice (GMP) per la produzione; Good Clinical Practice (GCP) per la sperimentazione preclinica. Quali sono I rischi associati a questo PTC (immunogenicità, tumore, teratoma, infezione, tossicità)? Rigetto immunologico : NO perché le MSC sono isolate a partire da una fonte di cellule autologhe. Formazione del tumore: SI dallo scaffold e dai fattori di crescita. Le MSC hanno un basso potenziale tumorigenico. Formazione di teratomi: NO perché non utilizziamo cellule staminali pluripotenti. Trasmissione di infezioni: SI da qualsiasi manipolazione. Somministrazione di contaminanti tossici: SI da qualsiasi manipolazione. What is the therapeutic product? What are the elements that identify the therapeutic product as a PTC? The recellularized construct (decellularized kidney, recellularized with MSC). The main therapeutic agent are MSCs, obtained after "non- minimal manipulation" consisting in rat kidney decellularization, recellularization with MSCs and their differentiation. In what phase of the regulatory process is localized this PTC? What are the standards that apply in this stage of the PTC process of development Pre -clinical (animal) trial. Good Manufacturing Practice (GMP) for the production; Good Clinical Practice (GCP) for the pre-clinical trial. What are the risks associated with this PTC (immunogenic, tumour, teratoma, infection, toxicity)? Immunological rejection : NO because MSCs are isolated from an autologous cell source. Tumor formation: YES from the scaffold and growth factors. The MSC have a low tumorigenic potential. Teratoma formation: NO because we do not use pluripotent stem cells. Transmission of infections: YES from any manipulation. Administration of toxic contaminants: YES from any manipulation. 5 5) Si compili la tabella sottostante elencando e discutendo tutti i tipi di cellule che potrebbero essere potenzialmente impiegati nell’uomo per la terapia in questione. (punti 5/33). Fonte cellulare (sulla base dell�immunogeni- cit�) Tipo/i cellulare /i Vantaggi Criticit� Autologhe MSC isolate da biopsia del paziente e differenziate in cellule renali. Compatibilità immunologica. Limitata invasività della biopsia Limitata reperibilità. Limitata espandibilità. Protocolli di ri-differenziazione limitati. Il rischio di tumore è trascurabile per MSC Autologhe iPS da cellule somatiche del paziente e ri- differenziate in cellule renali Compatibilità immunologica Protocolli di ri -differenziazione limitati. Rischio di teratoma. Singeniche Cellule embrionali isolate da clone del paziente e differenziate in cellule renali. Compatibilit� immunologica con eccezione per il DNA mitocondriale. Limiti etici, tecnici e regolatori per le cellule clonate. Protocolli di ri-differenziazione limitati. Rischio di teratoma. Alloge niche MSC i solate da donatore umano deceduto e differenziate in cellule renali. Possibilit� di industrializzazione. Ris chio di infezioni. L'immunogenicit� � bassa per le MSC. Xenogeniche MSC i solate da donatore non umano e differenziate in cellule renali. Largamente reperibili da allevamenti. Possibilità di industrializzazione. Rigetto immunitario acuto. Limitata funzionalità biologica. Trasmissione di xeno-zoonosi come ad esempio l’infezione da SARS-CoV-2. 6 5) Fill the table below by listing and discussing all the cell types that may be potentially used in humans for this therapy (points 5/33). Cell source (based on immunogenicity) Cell type/s Advantages Criticalities Autologous MSC isolated from a biopsy of the patient and differentiated into renal cells. Immunological compatibility Limited invasiveness of the biopsy. Limited availability. Limited expandability. Limited re-differentiation protocols. Risk of tumour is negligible for MSC. Autologous iPS from somatic cells of the patient, re-differentiated in renal cells. Immunological compatibility. Limited re -differentiation protocols. Risk of teratoma. Syngeneic Embryonic stem cells isolated from a clone of the patient and differentiated into renal cells. Immunological compatibility with the exception of the mitochondrial DNA. Ethical, technical and regulatory limitations for cloned cells. Limited redifferentiation protocols. Risk of teratoma. Allogeneic MSC isolated from a human deceased donor and differentiated into renal cells. Can be Industrialized. Risk of infection. Immunogenicity is low for MSC. Xenogeneic MSC isolated from a nonhuman Donor and differentiated into renal cells. Largely available from animal livestock. Can be industrialized. Acute immune rejection. Limited biological functionality. Transmission of xeno-zoonoses like the SARS-CoV-2 infection. 7 6) Il tempo di duplicazione delle MSC è t d=12h. Le MSC vengono isolate da una biopsia di midollo osseo. Il volume estratto è di 1ml, con una densità cellulare, N biopsia , di 10 6 cellule/ml. L’efficienza di isolamento delle MSC è del 10%. Una semina adeguata dello scaffold richiede un numero totale di cellule pari a X semina =2.56*10 7 cellule. Calcolare il tempo di espansione, t, necessario per raggiungere il numero minimo di cellule richiesto per la ricellularizzazione del rene. E’ richiesto il risultato numerico. I calcoli richiedono solo passaggi elementari, che possono essere svolti senza calcolatrice. (punti 2/33). Xf = X semina = 2.56*10 7cellule = 256*10 5 cellule X i = V biopsia *N biopsia *efficienza = 10 6*10% cellule = 10 5 cellule d = log(X f/X i)/log 2 = log 2(X f/X i) = log 2(256*10 5/10 5) = log 2(256) =8 oppure: 2 d = X f/X i  2 d = 256  d = 8 t = d*t d = 8*12h = 96h = 4 giorni 6) MSC doubling time is t d=12h. MSC are isolated from a bone marrow biopsy. The extracted volume is 1ml, with a cell density, N biopsy , equal to 10 6 cells/ml. The MSC isolation efficacy is 10%. Adequate seeding of the scaffold requires a total cell number equal to X seed =2.56*10 7 cells. Calculate the expansion time, t, necessary to reach the minimum number of cells required for kidney recellularization. Numeric result requested. Calculation only requires elementary passages, which may be done without a calculator. (points 2/33). Xf = X seed = 2.56*10 7cells = 256*10 5 cells X i = V biopsy *N biopsy *efficacy = 10 6*10% cells = 10 5 cells d = log(X f/X i)/log 2 = log 2(X f/X i) = log 2(256*10 5/10 5) =log 2(256)=8 or: 2 d = X f/X i  2d = 256  d = 8 t = d*t d = 8*12h = 96h = 4 days 8 7) Il rene bioingegnerizzato è un organo ricellularizzato con strutture vascolare, medullare e corticale preservate e con un sistema di raccolta e un suo uretere. Questo costrutto ricellularizzato viene perfuso con un mezzo di coltura completo in un bioreattore per la coltura dell’intero organo. L’unità microvascolarizzata generica del costrutto può essere modellata come un tessuto cilindrico con raggio R e lunghezza L, contenente un capillare co-assiale di raggio a. Queste unità sono allineate in parallelo e a contatto diretto tra di loro. Considerare una singola unità micro-vascolarizzata durante la perfusione nel bioreattore. Ii coefficiente di diffusione dell’ossigeno nel costrutto cellulare è costante e pari a D. Assumere il numero di Péclet di questo sistema maggiore di 1. Assumere la velocità media del mezzo di coltura molto alta, tale da rendere la concentrazione di ossigeno nel mezzo di coltura costante ed uguale a Co. Determinare il profilo di concentrazione di ossigeno nel costrutto cellulare durante la coltura nel bioreattore in condizione di stato stazionario ed assumendo simmetria cilindrica. Usare il sistema di coordinate dato nello schema. The bioengineered kidney is a recellularised organ with a preserved vascular, cortical and medullary architecture, and a collecting system and its ureter. This recellularised construct is perfused with complete culture medium in a whole-organ bioreactor. The generic micro-vascularized unit of the construct may be modelled as a tissue cylinder with radius R and length L, containing a co-axial capillary of radius a. These units are aligned in parallel and in direct contact between each other. Consider an individual micro-vascularized unit during perfused bioreactor culture. The oxygen diffusion coefficient in the cellularized construct is constant and equal to D. Assume the Péclet number of this system greater than 1. Assume the average velocity of the culture medium very high, hence the oxygen concentration in the culture medium is constant and equal to Co. Determine the oxygen concentration profile in the cellularized construct, during bioreactor culture, in steady state and assuming a cylindrical symmetry. Use the coordinate system given in the scheme. 7.1) Definire il volume di controllo in termini matematici. Scrivere l’equazione generale del trasporto di massa nel volume di controllo. Semplificare rimuovendo i termini che possono essere considerati nulli o trascurabili nel volume di controllo specificando la motivazione fisica. Riportare l’equazione finale semplificata che verrà impiegata nella risoluzione. (punti 3/33). 7.1) Define the control volume in mathematical terms. Write the general equation of mass transport in the control volume. Eliminate the terms that can be considered null or negligible within the control volume and justify why. Write the final simplified equation to be solved (points 3/33). Il volume di controllo è un cilindro cavo di tessuto con a