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Biomedical Engineering - Technology for Regenerative Medicine
ese04-ITA
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1 L’intero polmone ingegnerizzato Petersen et al. [“Tissue-Engineered Lungs for in Vivo Implantation”, 2010] hanno decellularizzato dei polmoni murini che, successivamente, hanno ricellularizzato con cellule epiteliali ed endoteliali della micro-vascolatura polmonare (isolate da polmoni di ratti neonati). L’obiettivo è progettare un bioreattore che possa mimare delle caratteristiche specifiche dell’ambiente polmonare di un essere umano adulto. In particolare, la perfusione vascolare (frecce rosse), che fornisce un medium ossigenato e ricco di glucosio ai polmoni, e il ciclico gonfiamento- sgonfiamento degli alveoli con un medium liquido, che mima la ventilazione polmonare (frecce verdi). Schema del bioreattore Struttura polmonare a livello alveolare \ Rispondere alle domande nella tabella: Qual è il prodotto terapeutico sopra descritto? Quali sono gli elementi che identificano questo prodotto terapeutico come PTC? In quale fase del processo regolatorio per nuovi PTCs può essere collocato questo PTC? Quali sono gli standard che si applicano a questo stadio del processo di sviluppo del PTC? Quali sono i rischi associati a questo PTC (immunogenico, tumore, teratoma, infezione, tossicità)? 2 Classificare tutte le sorgenti cellulari potenzialmente utilizzabili in pazienti umani per questa terapia Fonte cellulare (basata sul l’immunogenicità) Tipo/i cellulare Vantaggi Criticità E’ utilizzabile ? (SI/NO) Nota: terapia convenzionale = somministrazione di farmaci 3 ESERCIZIO A Sapendo che la portata del medium vascolare Q m è 5 ������������ ������������������������������������, la concentrazione arteriosa c 1 di glucosio è 4.86 mM [ P. Pezzati, M. Tronchin, G. Messeri. Biochimica clinica, 2004, vol. 28, n. 5-6 ] e la concentrazione venosa c 2 è più bassa del 5%, determinare il consumo totale di glucosio. Determinare, inoltre il consumo totale di ossigeno sapendo che la differenza di concentrazione artero-venosa è di 2 mM. Considerare che il trasporto di ossigeno alveolo-capillare (������������ ������������) è 310 ������������������������ ������������������������������������ e il volume molare di ossigeno è 17.36∗10 −3 ������������3 ������������������������������������ . ESERCIZIO B Il polmone è composto da oltre 40 tipi cellulari, tra cui: cellule epiteliali, endoteliali, tessuto connettivo interstiziale, vasi sanguigni, tessuto ematopoietico, tessuto linfoide e cellule mesoteliali che popolano la pleura. Una tipica biopsia di polmone contiene circa il 45% di cellule epiteliali di tipo II, il 2.5% di cellule epiteliali di tipo I e il 15% di cellule endoteliali. Dall’analisi istologica la densità cellulare totale (Nv) dopo 8 giorni di coltura è 404∗10 6������������������������������������������������ ������������ ������������������������ 3. Si consideri il volume polmonare umano di 3.5L. Si calcoli il numero di cellule per ogni tipo cellulare e il consumo cellulare di ossigeno e glucosio (si ricord a che l’unità di misura del consumo cellulare è [ ������������������������������������������������ ℎ∗10 6������������������������������������������������������������ ]). ESERCIZIO C I polmoni sono stati in coltura per 8 giorni; è noto che la divisione cellulare per le cellule epiteliali di tipo I e II avviene in 12 ore, mentre per le cellule endoteliali avviene in 36 ore. Se la concentrazione venosa c 2 di glucosio diminuisce più del 10% rispetto a c 1 (fare riferimento ai dati del primo esercizio), allora si verifica la condizione di ipoglicemia. Determinare il massimo numero iniziale di cellule per evitare l’ipoglicemia dopo 8 giorni di coltura. 1 Ingegneria tissutale d i un intero POLMONE Petersen et al. [“Tissue -Engineered Lungs for in Vivo Implantation”, 2010] hanno decellularizzato dei polmoni murini che , successivamente, hanno ricellularizza to con cellule epiteliali e d endoteliali della micro -vascolatura polmonare (isolate da polmoni di ratti neonati). L’obiettivo è progettare un bioreattore che possa mimare delle caratteristiche specifiche dell’ambiente polmonare di un essere umano adulto. In particolare, la perfusione vascolare (frecc e rosse ), che fornisce un medium ossigenato e ricco di glucosio ai polmoni, e il ciclico gonfiamento - sgonfiamento degli alveoli con un medium liquido, che mima la ventilazione polmonare (frecce verdi ). Schema del bioreattore Struttura polmonare a livello alveolare Rispondere alle domande nella tabella : Qual è il prodotto terapeutico sopra descritto? Polmoni murini decellularizzati + cellule epiteliali polmonari e cellule endoteliali della micro -vascolatura polmonare di ratto Quali sono gli elementi che identificano questo prodotto terapeutico come PTC? Il principale agente terapeutico utilizzato sono le cellule, ottenute dopo una “ non -minima manipolazione” che consiste nell’isolamento, nell’espansion e e nella semina in matrice biologica In quale fase del processo regolatorio per nuovi PTCs può essere collocato questo PTC? In vitro Quali sono gli standard che si applicano a questo stadio del processo di sviluppo del PTC? Good Laboratory Practice (GLP) Quali sono i rischi associati a questo PTC (immunogenico, tumore, teratoma, infezione, tossicità)? Reazione immunologica : Sì. Perché la fonte cellulare potrebbe non essere autologa , e per la matrice biologica che di cui è fatto lo scaffold. Formazione di tumore: Sì, endotelio ed epitelio sono ricchi di cellule staminali multipotenti e per la matrice biologica di cui è fatto lo scaffold (possibile presenza di cell ule multipotenti) . Formazione di teratoma: NO, perche’ non veng ono utilizzate cellule pluripotenti ridifferenziate. Trasmissione di infezioni: SI, dal materiale prelevato dal donatore o da qualsiasi manipolazione. Somministrazione di contaminanti tossici : SI, da qualsiasi manipolazione cellulare 2 Classificare tutte le fonti cellulari potenzialmente utilizzabili in pazienti umani per questa terapia Fonte cellulare (b asata sull’immuno genicità) Tipo/i cellulare Vantaggi Criticità E’ utilizzabile ? (SI/NO) Nota: terapia convenzionale = somministrazione di farmaci Autologa Cellule epiteliali ed endoteliali isolate dal polmone del paziente (ed espanse) Compatibilità immunologica Disponibilità ed espandibilità limitate Procedura invasiva NO Autologa iPS da cellule somatiche del paziente, ridifferenziate (in cellule epiteliali ed endoteliali del polmone ) Compatibilità immunologica Limiti nei protocolli di ri - differenziamento Rischio di teratoma NO Singenica Cellule staminali embrionali isolate da cloni del paziente e differenziate (in cellule epiteliali ed endoteliali del polmone. ) Compatibilità immunologica ad eccezione del DNA mitocondriale Limitazioni etiche, tecniche, regolatorie per l’util izzo di cloni cellulari Limiti nei protocolli di differenziamento Rischio di teratoma NO Allogenica Cellule epiteliali ed endoteliali del polmone isolate da donatore umano (ed espanse) Può essere industrializzato Abbastanza disponibile, considerato il solo utilizzo delle solo cellule che presentano la corrispondenza degli antigeni dei leucociti umani (HLA) Rischio di reazione immunitaria Rischio di tumore dalle cellule multipotenti nell’endotelio NO Xenogenica Cellule epiteliali ed endoteliali del polmone isolate da donatore non - umano (ed espanse) Elevata disponibilità da animali Può essere industrializzato Rischio di reazione immunitaria acuta Rischio di xeno -zoonosi Funzionalità biologica limitata Rischio di tumore da cellule staminali NO 3 ESERCIZIO A Sapendo che la portata del medium vascolare Qm è 5 ������ , la concentrazione arteriosa c1 di glucosio è 4.86 mM [P. Pezzati, M. Tronchin, G. Messeri. Biochimica clinica, 2004, vol. 28, n. 5-6] e la concentrazione venosa c2 è più bassa del 5% , determina re il consumo totale di glucosio . Determina re , inoltre il consumo totale di ossigeno sapendo che la differenza di concentrazione artero -venosa è di 2 mM. Considera re che il trasporto di ossigeno alveolo -capillare (������������) è 310 ������ e il volume molare di ossigeno è 17 .36 ∗10 −3 3 . DAT I: Qm=5 ������ c1g= 4.86 mM [1M=1 ] c2g= c1g-5% c1g ������������ =310 ������ =310 3 ������ . (trasporto di ossigeno alveolo capillare ) c1-O2-c2-O2=∆������2= 2mM O2 volume molare =17 .36 ∗10 −3 3 . Modello compartimentale : Vol ∙∂c ∂t= Q1∙c1 − Q2∙c2+ p− v SOLUZIONE : L’equazione del modello compartimentale è : ������ ������ ������ = ������1− ������2+ − Siccome • Non c’è accumulo di glucosio ������ ������ = 0 • Nel tessuto non c’è produzione di glucosio: =0. L’equazione può essere semplificata : ������ ∗∆= 2= 1− 0.05 1= 1∗0.95 = 4.86 ∗0.95 = 4.62 ∆= 1− 2= (4.86 − 4.62 ) = 0.24 = ������ ∗∆= 5 ������ ∗0.24 = 1.2 ������ 4 Per calcolare il consum o totale di ossigeno è possib ile utilizzare nuovamente il modello compartimentale, così adattato: ������ ������ ������ = ������1−������2− ������2−������2+ 2− 2 Siccome non c’è accumulo di ossigeno : ������ ������ = 0. 0 = ������1−������2− ������2−������2+ ������2− ������2= ������∆������2+ ������2− ������2 ������2= ������ ∗∆������2+ ������2 Possiamo modellare il trasporto di ossigeno dagli alveoli ai capillar i come una “produzione d’ossigeno distribuita”. La produzione d’ossigeno dev’essere convertita da volumetrica a molare: ������2= ������������ ������ = 310 3 ������ ∗10 −6 3 3 17 .36 ∗10 −3 3 = 17 .86 ������ Utilizzando il modello compartimentale, il consum o d’ossigeno totale può essere calcolato come segue: ������2= ������ ∗∆������2+ ������2 2= 5 ������ ∗2∗10 −3 + 17 .86 ∗10 −3 ������ = 27 .86 ������ 5 ESERCIZIO B Il polmone è compost o da oltre 40 tipi cellulari, tra cui: cellule epiteliali, endoteliali , tessuto connettivo interstiziale, vasi sanguigni, tessuto em ato poietico, tessuto linfoide e cellule mesoteliali che popolano la pleura. Una tipica biopsia di polmone contiene circa il 4 5% di cellule epiteliali di tipo II, il 2.5% di cellule epiteliali di tipo I e il 15% di cellule endoteliali. Dall’analisi istologica la densità cellulare totale (Nv ) dopo 8 giorni di coltura è 404 ∗10 6 3. Si consideri il volume polmonare umano di 3.5L . Si calcoli il numero di cellule per ogni tipo cellulare e il consumo cellulare di ossigeno e glucosio (si ricorda che l’unità di misura del c onsum o cellular e è [ ������ ℎ∗106 ]). DAT I 45% cellule epiteliali di tipo II 2.5% cellule epiteliali di tipo I 15% cellule endoteliali ttot = 8 giorni Nv = 404 ∗10 6 3 densità cellulare totale dopo 8 giorni Volpulmonary = 3.5l volume polmonare umano [1l=1dm 3=1000 cm 3] N.B. Dati dall’esercizio A: = 1.2 ������ 2= 27 .86 ������ SOLUZIONE : Calcolo il numero finale di cellule totale: ������,������ = ������ ������ ℎ= 404 ∗10 6 3 ∗3.5∗10 3 3= 1.414 ∗10 12 E successivamente le frazioni per ogni tipo cellulare: Xf_epII = 0.45*X f,total = 1.414 ∗10 12 ∗0.45 = 6.36 ∗10 11 Xf_epI = 0.025*X f,total = 1.414 ∗10 12 ∗0.025 = 3.54 ∗10 10 Xf_endo = 0.15*X f,total = 1.414 ∗10 12 ∗0.15 = 2.12 ∗10 11 Modello compartimental e: Vol ∙∂c ∂t= Q1∙c1 − Q2∙c2+ p− v Consumo globale [µ ℎ , µ ] Consumo cellulare Vcell [ µ 106 ∗ℎ] Consumo volumetrico V [µ ∗ℎ, µ 3∗ℎ] V= Vol Vcell= X ( Dove X è il numero di cellule ) 6 Si ipotizzi che tutti i tipi cellular i abbiano lo stesso consumo individuale , allora si può scrivere : ������ = 15% ������ + 2.5% ������ ������+ 45% ������ ������������+ 37 .5% ������ℎ Dove l’ultimo termine tiene in considerazione tutte le altre cellule (quelle che principalmente compongono il parenchima). Il consumo d’ossigeno in ������ ℎ∗106 per ciascun tipo cellulare è: ������������������ ������������ ������������ = ������������������������������ = 0.051 ������ 106 ∗ℎ ������2������������������������ = ������2 ������,������ = 1.182 ������ 10 6 ∗ℎ 7 ESERCIZIO C I polmoni sono stati in coltura per 8 giorni ; è noto che la divisione cellulare per le cellule epiteliali di tipo I e II avviene in 12 ore, mentre per le cellule endoteliali avviene in 36 ore. Se la concentrazione venosa c2 di glucosio diminuisce più del 10% rispetto a c1 (fare riferimento ai dati del l’eser cizio A), allora si verifica la condizione di ipoglicemia . Determina re il massimo numero iniziale di cellule per evitare l’ipoglicemia dopo 8 giorni di coltura. DAT I ttot = 8 giorni td,epith = 12h td,endo = 36 h c2,g_critical = c 1,g - 10% c1,g c1,g = 4.86 mM Qm=5 ������ Nv = 404 ∗10 6 3 densità cellulare totale dopo 8 giorni Volpulmonary = 3.5l = 1.2 ������ SOLUZIONE : I passaggi logici per risolvere questo esercizio sono: ������������= ������ 2 = 1 ∗ Xfr=N f*Vol ∶ ������= , ∶������, Dove , si calcola usando l’equazione del modello compartimentale come negli esercizi precedenti . Infatti, c onsiderando ������ ∗∆= E utilizzando: 2, = 1− 0.11= 0.91= 0.9∗4.86 mmol l = 4.37 mmol l Tempo espansione tcr = d cr*t d Numero di passaggi = (������,������ ������,������) 2 Numero di cellule Xf=N f*Vol 8 ∆ = 1− 2, = (4.86 − 4.37 ) = 0.49 mmol l Il valore critic o di consumo risulta essere: , = ������ ∗∆ = 5 ������ ∗0.49 = 2.45 mmol min Considerando proporzionali il consumo di glucosio e la densità cellulare, è possibile calcolare la densità cellulare critica a partire dalla corrente condizione non critica: ∶ ������= , ∶������, ������, = , ∗������ = 2.45 ������ ∗404 ∗10 6 3 1.2 mmol min = 8.15 ∗10 8 3 = 815 ∗10 6 3 Du nque , possiamo ricavare il numero di cellule per il quale si verifica la condizione critica: ������, = ������, ∗������ ������������ = 8.15 ∗10 8 ∗3500 = 2.85 ∗10 12 Separando le cellule epiteliali dalle endoteliali, si ottiene: ������,������ +������������, = (0.025 + 0.45 )������, = (0.025 + 0.45 )∗2.85 ∗10 12 = 1.36 ∗10 12 ������, , = 0.15 ������, = 0.15 ∗2.85 ∗10 12 = 4.28 ∗10 11 Il numero di cellule iniziali e finali sono legati tramite la formula ������, = 2 ������������ Il numero di divisioni, d, si calcola grazie a: = 1 ∗ dove td è il tempo di divisione cellulare e t tot è il tempo di espansione . ������������ = ������������������ = 1 12ℎ ∗8 ������������ = 16 ������������������ = 1 36ℎ ∗8 ������������ = 5.33 ������������������ Quindi , la quantità massima di cellule da avere all’inizio e tali per cui a 8 giorni non si arrivi ad un a condizione di ip oglicemia e’: ������������,������ , = ������,������ +������������, 2 = 1.36 ∗10 12 216 = 20 .8∗10 6 ������������, , = ������, , 2 = 4.28 ∗10 11 25.33 = 10 .6∗10 9