Biomedical Engineering - Technology for Regenerative Medicine

ese05-ITA

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1 Rigenerazione epatica Un gruppo di ricercatori (Uygun et al. [1]) ha recentemente dimostrato un nuovo approccio per l’ottenimento di graft epatici trapiantabili ottenuti a partire da matrici di fegato decellularizzate. Il processo di decellularizzazione impiegato permette di preservare struttura e funzionalità proprie del network microvascolare presente, consentendo così un successivo efficiente processo di ricellularizzazione della matrice epatica, tramite semina di epatociti e seguente perfusione per una coltura in vitro. I graft ricellularizzati hanno evidenziato funzionalità biologiche affini al fegato fisiologico, come secrezione di albumina e sintesi di urea, ad un livello comparabile al caso non patologico in vivo. Le dette matrici epatiche possono essere trapiantate in ratti, garantendo la vitalità degli epatociti impiantati e la loro funzionalità con minime manifestazioni ischemiche. I risultati presentati forniscono una prova sulla fattibilità della rigenerazione di graft epatici trapiantabili come un possibile trattamento per patologie a carico del fegato. Bibliografia [1] Uygun BE, Soto-Gutierrez A, Yagi H, et al. Organ reengineering through development of a transplantable re-cellularised liver graft using decellularised liver matrix. Nat Med. 2010;16(7):814-820 2 Rispondere alle domande di seguito: Qual è il prodotto terapeutico qui descritto? Quali elementi identificano il prodotto come PTC? In quale fase del processo regolatorio per l’approvazione di nuovi PTC si trova il PTC qui descritto? Quali sono gli standard che si usano in questo stadio di sviluppo del PTC? Quali sono i rischi associati a questo PTC (immunogenico, tumore, teratoma, infezione, tossicit�)? 3 Classificare tutte le sorgenti cellulari potenzialmente utilizzabili in pazienti umani per questa terapia: Sorgente cellulare (basata sull’immuno- genicità) Tipi cellulari Vantaggi Criticità È Utilizzabile? (S/N) Nota: TERAPIA CONVENZIONALE: trapianto allogenico ortotopico 4 E SERCIZI: In questo esercizio, la strategia sopra descritta viene applicata a un fegato umano. A. Il diametro reale del nucleo degli epatociti è D R = 5 µm; il diametro ottenuto dall'istologia, è D H = 0.1 cm. L'area della sezione istologica osservata al microscopio è A H = 0.71 x 0.87 cm 2. Considerando l'istologia in figura 1 con uno spessore tk = 2 µm, calcolare la densità degli epatociti (cellule / mL) fuoriusciti dal capillare sinusoidale all'ECM. Figure 1: Istologia mostrante cellule extravasate [2] B. Considerando la geometria nella figura 2, valutare il flusso del mezzo di coltura (Q CM ) per garantire che lo sforzo di taglio della parete sia mantenuto al di sotto di un valore critico (τ lim = 2 Pa). Si presume che la viscosità del mezzo di coltura e il diametro del capillare (dall'istologia nella figura 1) siano 7*10 -4 Pa*s and 20 µm, rispettivamente. Figure 2: Geometria del capillare sinusoidale e del tessuto circostante C. Ciascun epatocita secerne un quantitativo di urea (CO(NH 2)2) pari a P HE = 6.08*10 -12 g/h*cell. Il volume del fegato è di 1500 ml. Ipotizzando una produzione fisiologica di urea di P PH = 450 mmol/giorno, calcolare la densità cellulare (N v), in [10 9 cellule], necessaria per produrre questa quantità di urea. Considerando il risultato (N v), spiegare quali sono le implicazioni per l'ingegneria dei tessuti. D. Supponendo che il tempo di divisione degli epatociti (t d) sia 40 h, valutare il tempo di coltura (t) in un bioreattore necessario per raggiungere il numero di epatociti calcolato al punto C (X f = 185*10 9 cells). Il numero di cellule iniziale è X i = 50*10 6 cellule. 1 Rigenerazione epatica Un gruppo di ricercatori (Uygun et al. [1]) ha recentemente dimostrato un nuovo approccio per l’ottenimento di graft epatici trapiantabili ottenuti a partire da matrici di fegato decellularizzate. Il processo di decellularizzazione impiegato permette di preservare struttura e funzionalità proprie del network microvascolare presente, consentendo così un successivo efficiente processo di ricellularizzazione della matrice epatica, tramite semina di epatociti e seguente perfusione per una coltura in vitro. I graft ricellularizzati hanno evidenziato funzionalità biologiche affini al fegato fisiologico, come secrezione di albumina e sintesi di urea, ad un livello comparabile al caso non patologico in vivo. Le dette matrici epatiche possono essere trapiantate in ratti, garantendo la vitalità degli epatociti impiantati e la loro funzionalità con minime manifestazioni ischemiche. I risultati presentati forniscono una prova sulla fattibilità della rigenerazione di graft epatici trapiantabili come un possibile trattamento per patologie a carico del fegato. Bibliografia [1] Uygun BE, Soto-Gutierrez A, Yagi H, et al. Organ reengineering through development of a transplantable re-cellularised liver graft using decellularised liver matrix. Nat Med. 2010;16(7):814-820 2 Rispondere alle domande di seguito: Qual è il prodotto terapeutico qui descritto? Matrice epatica decellularizzata e ricellulariz zata con epatociti adulti Quali elementi identificano il prodotto come PTC? L’agente terapeutico principale sono gli epatociti ottenuti per manipolazione non-minima, consistente nell’isolamento, nella proliferazione e nella ricellularizzazione di una matrice decellularizzata. In quale fase del processo regolatorio per l’approvazione di nuovi PTC si trova il PTC qui descritto? Sperimentazione preclinica Quali sono gli standard che si usano in questo stadio di sviluppo del PTC? Good Manufacturing Practice (GMP) Good Clinical Practice (GCP) Quali sono i rischi associati a questo PTC (immunogenico, tumore, teratoma, infezione, tossicità)? Rigetto immunogenico : Sì, non è nota la fonte cellulare Formazione di tumore: Sì, dallo scaffold e cellule progenitrici Formazione di teratoma: Sì, ma SOLO in caso di impiego di cellule differenziate a partire da cellule a pluripotenza indotta Trasmissione di infezioni: Sì a causa di cellule e scaffold oppure da ogni tipo di manipolazione Somministrazione di contaminanti tossici: SI a causa del materiale proveniente da un donatore (cellule e scaffold) oppure da ogni tipo di manipolazione 3 Classificare tutte le sorgenti cellulari potenzialmente utilizzabili in pazienti umani per questa terapia: Sorgente cellulare (basata sull’immuno- genicità) Tipi cellulari Vantaggi Criticità È Utilizzabile? (S/N) Nota: TERAPIA CONVENZIONALE: trapianto allogenico ortotopico Autologa Epatociti isolat i da paziente ed espansi (o cellule ovali differenziate in epatociti) Compatibilit� immunologica Non ci sono cellule funzionanti NO (non ci sono cellule funzionanti) Autologa iPS da cellule somatiche del paziente e re- differenziate in epatociti Compatibilit� immunologica Limiti dei protocolli di re - differenziamento Rischio di teratoma NO (teratoma) Singenica Cellule staminali embrionali isolate da clone del paziente o dal paziente stesso e differenziate in epatociti Compatibilit� immunologica ad eccezione del DNA mitocondriale Limiti etici, regolatori e tecnici per cellule derivate da clone Limiti dei protocolli di re- differenziamento Rischio di teratoma NO (teratoma) Allogenica Epatociti isolati da donatore umano ed espansi (o cellule ovali diffe renziate in epatociti) Industrializzabil e Disponibile (solo per donatori HLA compatibili) Rischio di reazione immunogenica Rischio di tumore legato alla presenza di cellule progenitrici SI (sorgente cellulare analoga alla terapia convenzionale)* Xenogenica Epatociti isolate da donatore non umano Ampiamente disponibile da stock animale. Industrializzabile Rischio di rigetto immunogenico Rischio di xeno-zoonosi Funzionalità biologica limitata Rischio di tumore dovuto alla presenza di cellule progenitrici NO (tumore e reazione immunogenica) *Limitazioni del PTC: matrice biologica (sorgente di immunogenicità); bilancio costo-beneficio rispetto alla terapia convenzionale. 4 ESERCIZI: In questo esercizio, la strategia sopra descritta viene applicata a un fegato umano. A. Il diametro reale del nucleo degli epatociti è D R = 5 µm; il diametro ottenuto dall'istologia, è D H = 0.1 cm. L'area della sezione istologica osservata al microscopio è A H = 0.71 x 0.87 cm 2. Considerando l'istologia in figura 1 con uno spessore tk = 2 µm, calcolare la densità degli epatociti (cellule / mL) fuoriusciti dal capillare sinusoidale all'ECM. Figure 1: Istologia mostrante cellule extravasate [2] DATI Diametro del nucleo degli epatociti D R = 5 µm Diametro del nucleo degli epatociti ottenuti dall’istologia D H = 0.1 cm =0.1*10 4 µm Area della sezione istologica visibile al microscopio A H = 0.71 cm x 0.87 cm=0.6177cm 2 Spessore tk = 2 µm Epatociti fuoriusciti n=9 (contarli dalla figura) SOLUZIONE: La densità cellulare è N v= numero di cellule volume Il volume da considerare è: Vol=area della sezione istologica∗ (spessore della sezione istologica+2∗spessore di metà nucleo degli epatociti) La vera area della sezione istologica (A R) è : D R:D H=A R:A H→A R= 5 μm∙0.6177 cm 2∙10 8μm2 cm2 0. 1 cm∙10 4μm cm =3,09∙10 5 μm 2 DR/2 DR/2 tk 5 Dopo la cellularizzazione la densità cellulare è: N v= n A R�tk+ D R 2 +DR 2 �= 9 cellule 3,09∙105 μm 2∙( 2 μm+5 μm )=0.42∙10 −5cellule μ m3 =0.42∙10 7cellule mL B. Considerando la geometria nella figura 2, valutare il flusso del mezzo di coltura (Q CM ) per garantire che lo sforzo di taglio della parete sia mantenuto al di sotto di un valore critico (τ lim = 2 Pa). Si presume che la viscosità del mezzo di coltura e il diametro del capillare (dall'istologia nella figura 1) siano 7*10 -4 Pa*s and 20 µm, rispettivamente. Figure 2: Geometria del capillare sinusoidale e del tessuto circostante DATI Valore critico dello sforzo di taglio τ lim = 2 Pa Viscosità del terreno μ=7*10 -4 Pa*s Diametro capillare d= 20 µm a=d/2 SOLUZIONE La massima sollecitazione sulla parete può essere calcolata con l'equazione di Haagen-Poisseuille (dispense pag.120): τrz =− 4Q μ πa 3 Tale sforzo di taglio va mantenuto al di sotto del valor limite τ lim: τ max