Biomedical Engineering - Applicazioni Biotecnologiche e Bioreattori

Riassunto ABB (Candiani-Pelegatta)

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– Rilevamento immunologico ∗ Metodo diretto: Abs primario + marcatore fluorescente che lega ad uno specifico Ag ∗ Metodo indiretto: Abs primario legato ad antigene al quale sono aggiunti Abs secondari che si legano da una parte all’Ab pri- mario e portano con se enzimi, che vengono convertiti tramite substrato in pigmento insolubile, oppure direttamente marca- tore fluorescente amplificando il segnale rispetto al metodo di- retto – Microscopia e data-analysis 1.16 Elenco tecniche di analisi cellule/proteine/D- NA/RNA • FCM: tecnica analitica per conoscere dimensione (FSC), complessit`a (SSC) e CD presenti in una singola cellula (analisi fluorescenza di cel- lule marcate con fluorocromo+Ab specifico Ag d’interesse). Aggiunta di FACS (cellule caricate e flusso deviato) o funzionalizzazione delle cellule con Ab+particelle magnetiche (economico e grande scala cellulare) ! diventa tecnica preparativa • Proteine – Estrazione proteine: Detergenti (SDS anionico / carica nulla) + metodi fisici + inibitori proteasi ! ottenimento sufrattante (soluzione con proteine da studiare) – Saggio BCA (analisi quantitativa): permette di analizzare il quan- titativo proteico presente in soluzione utilizzando la legge di Beer- Lambert (calcolo concentrazione chimica in funzione dell’assorbanza di una radiazione elettromagnetica), si confronta il campione con una curva di calibrazione ottenuta diluendo a una soluzione a con- centrazione nota (curva valida solo per valori intermedi, no estremi) – Cromatografia (tecnica analitica/preparativa) ∗ Cromatografia TLC: tecnica utilizzata per separare 2 o pi`u pro- teine contenute in una soluzione in base all’anit`a con fase stazionaria/fase mobile (fasi immiscibili) ! eluizione misurata tramite RF ∗ Cromatografia liquida su colonna: tecnica utilizzata per sepa- rare 2 o pi`u proteine contenute in una soluzione facendole scor- rere in un tubo contenente fase stazionaria tramite una fase mobile ·Cromatografia gravinometrica: driving force gravit`a (per- meazione di gel ! sferette inerti che fungono da ostacolo / anit`a ! sferette funzionalizzate con Ab che legano Ag 40 (proteina) / scambio ionico ! sferette cariche positiva- mente o negativamente) ·Cromatografia HPLC: driving force pompa peristaltica, us- ata per il sequenziamento proteico (idrolisi totale/parziale) – ELISA Kit (analisi quantitativa): usato per osservare la concen- trazione di un solo tipo di proteina, utilizzo Ab + enzima (ALP) che converte il substrato ed emana colore ∗ ELISA indiretto: Ag sul fondo ! Ab primari ! Ab secon- dari funzionalizzati con ALP ! substrato incolore che diventa colorato ! misura intensit`a colore con legge Beer-Lambert ! amplificazione del segnale ma riconoscimento che rischia di es- sere non univoco ∗ ELISA sandwich: Ab primari sul fondo (Ab di cattura) ! Ag che lega Ab di cattura ! Ab primari funzionalizzati con ALP ! substrato incolore che diventa colorato ! misura intensit`a colore con legge Beer-Lambert ! riconoscimento univoco e si- curo della proteina d’interesse di cui ottengo la quantit`a – Elettroforesi in SDS-PAGE (analisi semiquantitativa, confronto con altri campioni): processo che consente di separare proteine in base al loro peso molecolare (Mw), essendo le proteine tutte di densit`a uguale formate da amminoacidi – We s t e r n B l o t ( a n a l i s i q u a n t i t a t i va ) : t e c n i c a a n a l i t i c a u s a t a p e r identificare specifiche proteine in un estratto cellulare (elettroforsi in SDS-PAGE + immuno rilevazione tramite Ab che legano Ag d’interesse) ! riconoscimento univoco (Mw + epitopo = singola proteina) – Saggio a flusso laterale LFA (tecnica analitica): dispositivi a basso costo che combinano cromatografia TLC + sonde di bioriconosci- mento (Ab marcato + Ag) • DNA (acidi nucleici) – Southern Blot: tecnica che consente di visualizzare frammenti di DNA target in campioni complessi (elettroforesi in gel d’agarosio per separazione + sonda d’ibridazione per rilevamento innestata tramite capillary blot (DNA sperma di salmone)) 41