Types of cromatography 1

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LEZIONE 3 – PROTEOMICS _ 18 marzo SEC – SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY È il tipo di cromatografia più particolare: separa le proteine in base al loro peso molecolare, perché è l’unico caso in cui la fase stazionaria non è funzionalizzata, ma è costituita solo da sferette a matrice polimerica. Esse non contengono specifici ligandi, ma saranno loro stesse che fungeranno da setaccio. Possono dare luogo a diverse porosit à: si possono avere sferette macroporose o microporose, quindi ogni sferetta è costituita al suo interno da pori, i quali avranno dimensioni diverse. La SEC sfrutta le diverse dimensioni dei pori per facilitare o meno l’internalizzazione delle proteine all’interno dei diversi pori. È l’unico caso in c ui vogliamo la diffusione trasversale, cioè abbiamo un’interazione delle proteine con la struttura interna delle sferette. Negli altri casi invece devono interagire solo attraverso il ligando e non con la matrice polimerica. Abbiamo quindi un pool proteico con proteine con diversi pesi molecolari quindi con diverso ingombro sterico, che passa su una matrice polimerica costituita da pori di diverse dimensioni. Le proteine iniziano a diffondere in maniera più o meno efficiente all’interno dei pori a seconda del loro ingombro sterico: - Particelle grandi: interazione minima, eluiscono per prime perché non riescono a essere trattenute dalla fase stazionaria. - Particelle piccole: riescono a entrare nella matrice ed eluiscono per ultime. CROMATOGRAMMA: 1) Primo picco: particelle con peso molecolare così elevato che impedisce loro di diffondere in maniera efficiente all’interno della sferetta polimerica 2) Picchi intermedi: gruppi di proteine che avranno un peso molecolare inferiore rispetto alle proteine eluite da subito e quindi rimarranno all’interno della fase…