Western blotting Immunoblotting

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LEZIONE 7 – PROTEOMICS _ 1° aprile QUIZ DOMANDA 1 Il gel di agarosio si usa per acidi nucleici mentre il gel di poliacrilammide per le proteine. Il gel gradientato ha una concentrazione minore in alto e maggiore in basso, per avere una maggiore risoluzione man mano che si va avanti e risolvere proteine più piccole. DOMANDA 2 Una delle fu nzioni per la quale è utilizzata è proprio quella di denaturare le proteine, ma un’altra è di attaccare una carica negativa alle proteine per poi applicare un campo elettrico. WESTERN BLOTTING – IMMUNOBLOTTING È una tecnica elettroforetica usata quando si vuole determinare la presenza di una determinata proteina o un pool molto ristretto di proteine (famiglia) presente nel campione. Partendo da un iniziale campione complesso di proteine, per visualizzare una o poche proteine simili si combina l’elettroforesi con l’utilizzo di anticorpi: l’anticorpo riconosce in maniera più o meno efficiente ed efficace una certa proteina. Ci sono vari steps: 0) Fare l’SDS page: si prepara il gel con le opportune caratteristiche in base alla proteina da selezionare. Si carica il campione, si fa avvenire la corsa e ci si ferma al momento di conclusione della corsa, ovvero non andiamo a colorare il gel. Non ci interessano tutte le bande, infatti ci interessa andare a visualizzare solo la (o le) banda (e) che contiene la nostra proteina di interesse. 1) Trasferimento: si trasferisce fisicamente il gel su una membrana. Dopo alcuni step di lavaggio, verrà incubato l’anticorpo sulla membrana. 2) Riconoscimento da parte dell’anticorpo primario : l’anticorpo può riconoscere una o più proteine. L’anticorpo scelto va a riconoscere l’epitopo sulla proteina che si trova ora sulla membrana, quindi sulla membrana avremo proteine e anticorpo. 3) Dopo altri step di…