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LABORATORIO 1 _ 15 aprile VIDEO 1 – Protocollo di lisi in condizioni native https://www.youtube.com/watch?v=I3WGAl3oe1E native cell lysis 1) Coltivo le cellule 2) Tolgo il medium con una pipetta 3) Lavo 4) Spipetto per estrarre le proteine, che sono solo appoggiate sul fondo 5) Le metto in una Falcon 6) Centrifugo in modo blando: velocità massima di 4000-5000 rmp, permette di separare cellule intere. Usiamo una bassa temperatura per non danneggiare le proteine. 7) Ottengo sul fondo un pellet di cellule intere e sopra un surnatante 8) Elimino il surnatante 9) Metto il buffer di lisi, che è fondamentale, con pH vicino o uguale a quello fisiologico (7.4):  Tris-HCl pH7.4 : è un sale, uno dei più diffusi in proteomica ; il valore di pH è ottenuto aggiungendo un HCl, che è un acido, presente in alcune parti del corpo umano, quindi è spesso usato per creare buffer utili per la lisi e durante i vari step.  NaCl: il sale può aiutare la lisi cellulare per creare un ambiente co n un’elevata concentrazione di ioni e quindi l’acqua, che non ha bisogno di mediatori, fuoriesce, facendo collassare la cellula perché si destabilizza la membrana.  EDTA: è un chelante, usato per interagire con il materiale nucleico. Quando lisiamo le cellule, rompiamo la membrana esterna ma anche le membrane degli organuli interni. In una lisi in condizione nativa, questa lisi a volte non avviene o avviene in maniera blanda, comunque è un processo che non riusciamo a controllare al 100%: dobbiamo aggiungere quindi reagenti che vadano a chelare tutto ciò che non è proteico.  Triton X -100: è uno dei detergenti più utilizzati, introdotto in percentuali abbastanza consistenti (maggiori o uguali all’unità percentuale). Esso serve per favorire la solubilizzazione, l’estrazione di quelle proteine lipofile,…