Mass spectometry

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LEZIONE 8 – PROTEOMICS _ 2 aprile QUIZ DOMANDA 1 0) L’immunoblotting inizia sempre con una fase di corsa elettroforetica, che può essere monodimensionale o bidimensionale. Senza il gel ottenuto dalla corsa elettroforetica non è possibile ovviamente nessun blotting. 1) Transfer: vero step di blottaggio, ovvero trasferimento di proteine da gel a membrana 1.2) Step intermedi di lavaggio della membrana e blocking, cioè quello step che permette di lavare la membrana con una soluzione di BSA o di latte liofilizzato, per bloccare tutti i siti aspecifici presenti sulle membrane costituite da polimeri naturali, come quelle in nitrocellulosa, così che non si creino segnali aspecifici che inficerebbero la qualità del risultato finale 2) Incubazione con l’anticorpo primario: esso riconosce la proteina d’interesse 3) Incubazione con anticorpo secondario: rende visibile l’anticorpo primario, perché ha legato a sé un enzima che catalizza una reazione che verrà visualizzata 4) Detection: visualizzazione delle bande in diversi modi, di solito viene aggiunto un substrato, riconosciuto dal l’enzima legato all’anticorpo secondario, che catalizza una certa reazione. In proteomica di solito questi enzimi appartengono alle perossidasi, che catalizzano reazioni redox. Il substrato è ossidato dalla perossidasi in un prodotto in grado di emettere u n segnale, o sul visibile, o fluorescenza UV. Questo segnale viene acquisito con strumentazione o lastra usata in radiologia. DOMANDA 2 Condizioni migliori non sono quelle che bisogna per forza sempre seguire, ma quelle che ottimizzano. - Anticorpo primario: è scelto quasi sempre monoclonale - Anticorpo secondario: è scelto quasi sempre tra i policlonali - Detection indiretta: utilizzo di 2 anticorpi, uno per la proteina x e l’altro per la reazione…