Types of cromatography 3

Page 1

LEZIONE 5 – PROTEOMICS _ 25 marzo QUIZ DOMANDA 1 Se il pH aumenta c’è una concentrazione di H+ più bassa. Le proteine ne risentono e intervengono in modo da liberare ioni H+, quindi i COOH rilasciano ioni H+ diventando COO-. DOMANDA 2 L’aggettivo anionico si riferisce alla carica della proteina, non dello scambiatore stesso, quindi legano proteine con carica negativa. DOMANDA 3: TRE CARATTERISTICHE DEGLI SCAMBIATORI DEBOLI IN IEX Un parametro è la forza ionica della fase stazionaria. Hanno una capacità di legare le proteine che può variare, perché possono cambiare la loro ionizzazione. Sono delle resine che possono cambiare la loro densità di cariche a seconda del pH di lavoro, perché contengono gruppi acidi o basici (protonare caricand osi positivamente, deprotonare caricandosi negativamente). Quindi variando il pH posso anche variare la selettività di carica, quindi la capacità della resina di interagire in maniera più o meno forte con la proteina. Ci sono tempi di equilibrazione lunghi: per far sì che assuma una certa densità di carica, noi dobbiamo caricare la colonna con un buffer a un certo pH. Sul datasheet c’è una tabellina in cui è riportata la densità di carica da applicare. Questa fase durerà di più rispetto a tutte le altre f asi di equilibrazione viste e anche rispetto a se usassimo gli scambiatori forti, perché bisogna dare tempo a tutti i gruppi di ionizzarsi a seconda del pH di esercizio. Sono reversibili: posso variare la densità di carica su questi scambiatori continuamente nel tempo. Utilizzando lo stesso tipo di scambiatore posso programmare delle analisi cromatografiche con densità di carica completamente diverse, usando un buffer con pH idoneo. Ma come faccio a resettare la ionizzazione fornita con una determinata analisi? Andando a ridurre al…